李 瑤 辛 穎

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)，一般指出生體重低于同胎齡、同性別平均出生體重的P10或同胎齡、同性別平均出生體重2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以下的新生兒[1]。近10年來的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，出生體重與成年后的冠心病、高血壓和2型糖尿病有密切關(guān)系，其中2型糖尿病和高血壓是代謝綜合征的組分，與脂代謝異常、肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān)，而代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)是胰島素抵抗[2]。本研究建立大鼠IUGR模型[3]，采集IUGR模型鼠產(chǎn)下仔鼠不同時(shí)點(diǎn)胰腺、肝臟和骨骼肌組織，以RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)胰島素受體底物1(IRS-1)和IRS-2表達(dá)水平，其中胰腺組織的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示，IRS-2 mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著下降[4]，提示IRS-2是調(diào)控胰島β細(xì)胞生長發(fā)育的主要受體物質(zhì)；IUGR個(gè)體從出生后至成年期胰腺組織可能存在IRS-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。本研究進(jìn)一步檢測(cè)肝臟和骨骼肌組織的ISR-1和ISR-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，探討外周組織是否存在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，并與胰腺組織相關(guān)結(jié)果進(jìn)行比較，分析胰腺和外周組織胰島素抵抗的差異。

1 方法

1.1 儀器、試劑和IUGR大鼠模型制備 本研究所使用的儀器、試劑以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同文獻(xiàn)[4]。予大鼠孕期低蛋白飼料喂養(yǎng)制備IUGR模型，以模型鼠產(chǎn)下的仔鼠為IUGR組；以孕期予正常飲食的母鼠產(chǎn)下的仔鼠為對(duì)照組，具體方法參見文獻(xiàn)[4]。所有孕鼠均自然分娩，稱量新生仔鼠體重精確至0.01 g。IUGR仔鼠判斷標(biāo)準(zhǔn)：新生鼠出生體重低于對(duì)照組平均出生體重的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[1]。符合IUGR的仔鼠保留。

1.2 標(biāo)本采集 兩組仔鼠以母乳喂養(yǎng)，母鼠均飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料。IUGR組和對(duì)照組仔鼠滿3周后斷乳，分籠飼養(yǎng)，均飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，觀察兩組仔鼠的發(fā)育情況，記錄每周體重。兩組以出生后0、3和8周為觀察時(shí)點(diǎn)，各選取8只仔鼠。于出生后(0周)立即處死并留取胰腺、肝臟和骨骼肌組織；3和8周時(shí)點(diǎn)采集標(biāo)本前禁食12 h，次日晨以摘眼球法采血，分離血清，隨后處死仔鼠并留取胰腺、肝臟和骨骼肌組織。均置于-70℃冰箱保存。

1.3 ISR-1和ISR-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 大鼠IRS-1，IRS-2和內(nèi)參照β-actin引物參照Gene Bank中的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。分別稱取100 mg胰腺、肝臟和骨骼肌組織，用Trizol試劑抽提RNA，以RT-PCR法分析IRS-1、IRS-2 mRNA的表達(dá)水平。采用Western blot技術(shù)檢測(cè)IRS-1和IRS-2蛋白的表達(dá)水平。具體的操作步驟見文獻(xiàn)[4]。

1.4 空腹血糖和血清胰島素測(cè)定 ①空腹血糖：采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測(cè)定。②血清胰島素測(cè)定：按說明書要求處理試劑，配制洗液；加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記血清樣品編號(hào)，加入100 μL的樣品于空白微孔中；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液；37℃恒溫水浴箱水浴60 min;洗扳機(jī)清洗5次，每次靜置10 s;每孔加入底物A、B液各50 μL，37℃恒溫避光孵育15 min,加入50 μL終止液終止反應(yīng)，在450 nm波長下以酶標(biāo)儀讀取各孔A值，計(jì)算胰島素含量。

1.5 空腹胰島素抵抗指數(shù)(FIRI)計(jì)算公式如下：

其中FPG為空腹血糖，F(xiàn)INS為空腹胰島素。

2 結(jié)果

2.1 孕期低蛋白對(duì)仔鼠生長發(fā)育的影響 IUGR組和對(duì)照組孕鼠平均孕期和產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異。IUGR組出生體重顯著低于對(duì)照組，(3.92±0.22)gvs(4.94±0.32)g。3周時(shí)點(diǎn) IUGR 組平均體重仍顯著低于對(duì)照組，(27±4)gvs(35±4)g；8周時(shí)點(diǎn)IUGR組體重顯著高于對(duì)照組，(160±17)gvs(139±8)g。

2.2 胰腺、 肝臟和骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 RT-PCR結(jié)果顯示， IUGR組胰腺、肝臟IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IUGR組0、3和8周時(shí)點(diǎn)骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(表1，圖1和圖2A)。 至8周時(shí)點(diǎn)，骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的下降幅度較胰腺和肝臟組織明顯。

2.3 胰腺、肝臟和骨骼肌IRS-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 表2顯示，IUGR組0、3和8周時(shí)點(diǎn)，胰腺、肝臟IRS-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；骨骼肌IRS-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟IRS-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的下降幅度較胰腺明顯(表2，圖1和圖2B)。

2.4 兩組糖代謝的比較 兩組仔鼠3周時(shí)點(diǎn)的空腹血糖、胰島素水平及FIRI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；8周時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組比較，IUGR組空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，胰島素水平和FIRI顯著升高(表3)。

GroupIRS-1mRNA0week3weeks8weeksIRS-1protein0week3weeks8weeksPancreasControl(n=8)1.04±0.081.03±0.081.03±0.08101±7104±8105±8IUGR(n=8)1.0±0.070.96±0.071.02±0.0799±7102±8104±8t1.0330.7540.40.520.50.25P0.10.40.50.50.50.5LiverControl(n=8)1.0±0.081.04±0.081.03±0.08124±9133±9125±10IUGR(n=8)1.0±0.051.03±0.081.01±0.08119±9129±8122±10t00.350.711.130.90.61P0.50.50.50.20.40.5SkeletalmuscleControl(n=8)1.1±0.071.05±0.071.09±0.08137±10135±10135±10IUGR(n=8)0.91±0.070.93±0.060.74±0.07111±12104±996±7t5.423.693.834.766.689.15P0.0010.0050.0020.0010.0010.001

GroupIRS-2mRNA0week3weeks8weeksIRS-2protein0week3weeks8weeksPancreasControl(n=8)1.13±0.081.11±0.091.08±0.06155±11151±11155±13IUGR(n=8)0.98±0.070.83±0.060.79±0.06138±10121±9110±8t47.369.933.3268.57P0.0020.0010.0010.0050.0010.001LiverControl(n=8)1.0±0.071.02±0.081.1±0.07171±10171±12174±12IUGR(n=8)0.85±0.070.73±0.060.69±0.05136±9126±9103±8t4.228.2116.667.187.1814.2P0.0010.0010.0010.0010.0010.001SkeletalmuscleControl(n=8)1.17±0.261.07±0.071.1±0.07115±8114±8113±8IUGR(n=8)1.0±0.0811.0±0.071.03±0.08112±8113±9104±8t1.821.840.750.230.74P0.10.10.10.40.50.4

表3 IUGR組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)空腹血糖、血清胰島素水平和FIRI比較

圖1 IUGR組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)胰腺、肝臟和骨骼肌的IRS-1、IRS-2 mRNA的表達(dá)

Fig 1 IRS-1 and IRS-2 mRNA expression in pancreas, liver and skeletal muscle of rats at 0, 3 and 8 week

Notes w: week; 1-6: pancreas; 7-12: liver; 13-18: skeletal muscle

圖2 IUGR組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)胰腺、肝臟、骨骼肌的IRS-1、IRS-2蛋白表達(dá)

Fig 2 IRS-1 and IRS-2 protein expression in pancreas, liver and skeletal muscle of rats at 0, 3 and 8 week

Notes w: week; A: IRS-1 protein expression; B: IRS-2 protein expression

3 討論

近年來IUGR與成年期以胰島素抵抗為特征的代謝性綜合征的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)[5]。胰島素抵抗可由胰島素受體缺陷所致。ISR蛋白是多種受體信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的底物，胰島素受體底物與磷酸化的胰島素受體β亞基結(jié)合后，作為船塢蛋白，其酪氨酸殘基的磷酸化為下游的信號(hào)蛋白提供了一個(gè)高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖及促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雌性大鼠孕期低蛋白飲食所致IUGR仔鼠8周時(shí)點(diǎn)體重顯著高于對(duì)照組，出現(xiàn)肥胖傾向，胰島素水平和FIRI顯著高于對(duì)照組，提示出現(xiàn)了胰島素抵抗。

IRS-1主要在骨骼肌表達(dá)，促進(jìn)肌肉攝取利用葡萄糖。IRS-2大量表達(dá)于肝臟和胰腺β細(xì)胞，促進(jìn)肝臟糖原合成和抑制肝葡萄糖輸出；作為調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能的重要信號(hào)分子，IRS-2主要調(diào)節(jié)β細(xì)胞增殖、生長和存活[7]。本研究進(jìn)一步分析了IRS-1、IRS-2 mRNA和蛋白在胰腺、肝臟和骨骼肌組織的表達(dá)，結(jié)果顯示IUGR組在出生后0、3和8周時(shí)點(diǎn)胰腺和肝臟組織IRS-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，提示IUGR個(gè)體從出生后至成年期不僅存在胰腺組織胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，還可能存在外周組織胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。

肝臟在機(jī)體能量平衡尤其糖脂代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，肝臟胰島素抵抗在2型糖尿病中起主導(dǎo)作用[8]。肝臟發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，可導(dǎo)致糖異生和肝糖元輸出增加，引起空腹高血糖和高胰島素血癥；此外胰島素抑制內(nèi)臟和皮下脂肪動(dòng)員，促進(jìn)脂肪酸氧化的作用減弱，使得進(jìn)入肝臟的游離脂肪酸水平增加，作用于肝細(xì)胞內(nèi)的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而加重肝臟胰島素抵抗[9]。本研究結(jié)果顯示，肝臟組織ISR-2 mRNA和蛋白水平顯著低于胰腺和骨骼肌，提示肝臟在胰島素抵抗中可能發(fā)揮較大作用。

本研究IUGR大鼠在3周時(shí)點(diǎn)，胰島素水平和FIRI較對(duì)照組無顯著升高，但已可觀測(cè)到胰腺、肝臟IRS-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的降低，提示可能出現(xiàn)胰島素抵抗的傾向。8周時(shí)點(diǎn)觀測(cè)到胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)的升高，提示出現(xiàn)胰島素抵抗，而該時(shí)點(diǎn)胰腺和肝臟中IRS-2 mRNA和蛋白水平、骨骼肌IRS-1 mRNA和蛋白水平均較低，進(jìn)一步證實(shí)了胰島素抵抗與IRS-1、IRS-2 mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。

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