李春明 李正華 于文喜* 戴偉男

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究院，哈爾濱 150081)

酚類物質(zhì)為植物體內(nèi)合成的在結(jié)構(gòu)上含有芳香環(huán)酚羥基及其相關(guān)衍生物的一大類化合物，是植物次生代謝產(chǎn)物的重要類群。黃酮類化合物是色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物，是酚類物質(zhì)中重要的一類。研究表明，植物中的酚類次生代謝產(chǎn)物與植物抵御低溫傷害能力相關(guān)[1～2]。

楊樹(shù)是我國(guó)北方地區(qū)的重要造林和綠化樹(shù)種，而楊樹(shù)凍害也是困擾林業(yè)生產(chǎn)和園林綠化的一個(gè)重要問(wèn)題。楊樹(shù)含有豐富的酚類次生代謝產(chǎn)物[3]，但酚類物質(zhì)變化與楊樹(shù)抗寒能力的關(guān)系卻不明確。

總酚[4～5]和黃酮[6～]含量的測(cè)定方法已有較多報(bào)道，但同時(shí)測(cè)定兩類成分的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。本文利用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和超聲波提取法探討了同時(shí)測(cè)定楊樹(shù)中黃酮和總酚含量的方法，并選擇秋冬氣候驟變時(shí)期采集樣樹(shù)葉片，測(cè)定總酚、黃酮含量的變化，初步分析了總酚、黃酮含量與氣溫變化之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：實(shí)驗(yàn)所用銀中楊(Populusalba×berolinensis)抗凍能力較差，而迎春5號(hào)(PopulusבZhonglinSanbei1’)抗凍能力較強(qiáng)，均為哈爾濱市行道樹(shù)。從10月23日(2005年)氣溫驟降開(kāi)始至10月31日葉片全部凋落，每日采集葉片樣品測(cè)定總酚、黃酮含量。每個(gè)品種選擇3株成樹(shù)，每樹(shù)每日采集一個(gè)枝條，收集同一枝條的所有葉片作為一個(gè)樣品，80℃干燥24h后粉碎備用。

儀器：U-2800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本HITACHI公司)；Biofuge 22R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus sepatech公司)；AB104型電子天平(瑞士)；KQ-100DB超聲波儀(江蘇昆山超聲儀器公司)。

試劑：試劑均為分析純，蘆丁購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，沒(méi)食子酸購(gòu)自Alfa Aesar公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

總酚含量測(cè)定以沒(méi)食子酸為對(duì)照品。精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品100mg，95%乙醇定容至25mL，搖勻，作為母液備用。黃酮含量測(cè)定以蘆丁為對(duì)照品。精密稱取蘆丁對(duì)照品100mg，95%乙醇定容至25mL，搖勻，作為母液備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以95%乙醇為溶劑稀釋沒(méi)食子酸、蘆丁母液，分別得到?jīng)]食子酸濃度為0.062 5，0.125，0.25，0.5，1mg/mL，蘆丁濃度為0.125，0.25，0.5，1，2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照選定的分析測(cè)定條件，分別對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分析，每樣重復(fù)測(cè)定3次。分別以質(zhì)量濃度(mg/mL)為X值，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得總酚(A1，沒(méi)食子酸為對(duì)照品)、黃酮(A2，蘆丁為對(duì)照品)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：A1=3.5885X2+0.1226，R1=0.9999，線性范圍：0.025～0.4mg/mL；A2=1.099X1+0.0038，R2=0.9996，線性范圍：0.0625～1mg/mL。

1.4 紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定條件

總酚含量測(cè)定的顯色方法及測(cè)定條件參照Graham的方法[8]，黃酮含量測(cè)定的顯色方法及測(cè)定條件參照席先蓉方法[9]。

1.5 樣品制備

影響植物中有效成分超聲提取的因素主要有提取溶劑、超聲頻率、提取時(shí)間等。本研究選擇了乙醇濃度和提取時(shí)間進(jìn)行了超聲提取楊樹(shù)葉片中黃酮和總酚的2因素11水平的均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)(表1)，以總酚、黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討了同時(shí)測(cè)定楊樹(shù)葉片中總酚和黃酮含量的最佳樣品制備方法。

精密稱取1g楊樹(shù)葉片樣品于25mL容量瓶中，按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)條件，分別加入不同濃度的乙醇溶液23mL(每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次)，在工作頻率40kHz、功率100W的條件下超聲波提取相應(yīng)的時(shí)間，冷卻至室溫后用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至刻度。移取1.5mL上清液2份至離心管中，離心(12 000r/min)10min，分別測(cè)定總酚和黃酮提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品制備條件的確定

表1均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件及分析結(jié)果

S均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。分別以乙醇濃度(X1)提取時(shí)間(X2)為自變量，以總酚提取率(Y1)、黃酮提取率(Y2)為因變量，用均勻設(shè)計(jì)2.0版數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得回歸方程如下：

Y1=12.031234+0.366653X1-0.069874X2

-0.003703X12

Y2=32.581580+0.589014X1-0.282421X2

-0.005724X12+0.002023X1X2

進(jìn)行各因素對(duì)總酚及黃酮提取率影響的逐步回歸模型分析表明，乙醇濃度對(duì)總酚及黃酮提取率的影響較大，而提取時(shí)間的影響較小。對(duì)各試驗(yàn)條件進(jìn)行綜合分析，確定了最佳提取條件為50%乙醇超聲波提取5min。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱取5份楊樹(shù)葉粉于25mL容量瓶中，每份1g，以23mL的50%乙醇為溶劑，超聲波提取5min，冷卻后50%乙醇稀釋至刻度，取1mL離心后在測(cè)定總酚和黃酮含量，測(cè)得總酚和黃酮吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.4%和2.57%。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取6份楊樹(shù)葉粉，每份0.5g，其中3份分別加入沒(méi)食子對(duì)照品10mg，另外3份各加入蘆丁對(duì)照品20mg，按樣品制備及測(cè)定方法進(jìn)行定量分析，測(cè)得總酚加樣回收率和RSD為104.57%和2.26%，黃酮的分別為103.12%和1.92%。

2.4 楊樹(shù)葉片總酚、黃酮含量隨氣溫的變化

從10月23日到10月31日，銀中楊、迎春5號(hào)葉片的總酚、黃酮含量均隨氣溫的變化而變。從圖1可以看出，總酚、黃酮含量的變化規(guī)律在2個(gè)樹(shù)種中并不一致，而同一樹(shù)種中的總酚和黃酮含量卻有相似的變化趨勢(shì)。

總體上看，銀中楊葉片的總酚、黃酮含量在此期間變化幅度較小，而且隨著氣溫的升、降而增、減，但在初期(23—27日)反應(yīng)略有滯后(1d)。迎春5號(hào)葉片的總酚、黃酮含量變化幅度相對(duì)較大，趨勢(shì)則與銀中楊正好相反，即隨著氣溫的升、降而減、增，但也是在初期(23—27日)反應(yīng)略有滯后(1d)。兩種楊樹(shù)葉片的總酚含量基本相當(dāng)，而黃酮含量卻有差異，10月26日以后采集的樣品中，銀中楊的黃酮含量明顯高于迎春5號(hào)(圖1)。

植物體內(nèi)酚類成分的含量被認(rèn)為是評(píng)價(jià)抗寒性能的最佳生化標(biāo)記之一[10]，經(jīng)過(guò)逆境誘導(dǎo)的植物抗凍性增強(qiáng)，與其酚類成分的變化有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)性[1]。從本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，在氣溫劇烈變化時(shí)，抗凍能力較強(qiáng)的迎春5號(hào)葉片中的總酚、黃酮含量能夠應(yīng)對(duì)氣溫變化而有較大幅度的變化，而抗凍能力較差的銀中楊卻不是這樣?？磥?lái)這兩種楊樹(shù)抗凍能力的差異可能與酚類成分含量是否能夠應(yīng)對(duì)氣溫變化作出合適的調(diào)整有關(guān)，而與酚類成分含量的絕對(duì)大小不明顯相關(guān)。

3 結(jié)論

(1)建立了一種同時(shí)測(cè)定楊樹(shù)中總酚和黃酮含量的方法；運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)法考查了楊樹(shù)中總酚、黃酮的超聲提取條件，最佳提取工藝條件為50%乙醇超聲波提取5min。

(2)2005年10月下旬氣溫變化較劇烈時(shí)，用上述方法測(cè)定了銀中楊和迎春5號(hào)葉片的總酚和黃酮含量的變化。銀中楊葉片的總酚和黃酮含量隨氣溫升、降而增、減，變化幅度較小。迎春5號(hào)葉片則不同，在氣溫降低時(shí)能迅速(稍有滯后)增加總酚和黃酮含量，并在氣溫升高時(shí)回落，變幅較大。

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