李淑瑾，張曉靜，付麗紅，叢 斌

（河北醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)系 河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 石家莊050017）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們法律意識的提高，涉及親權(quán)鑒定的法律案件與糾紛日益增多，具有司法鑒定資質(zhì)的親權(quán)鑒定機構(gòu)也逐年增加。盡管鑒定方法日趨標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化，但案件數(shù)量和種類的增加為親權(quán)鑒定案件的判定帶來一些新的問題與爭議。本文就近年來關(guān)于親權(quán)鑒定的若干新的技術(shù)與理論問題進(jìn)行綜述。

1 遺傳標(biāo)記

1.1 常染色體STR

目前國際上應(yīng)用最廣泛的商品化常染色體STR試劑盒主要有美國AB公司的IdentifilerR○試劑盒（ID）和Promega公司的PowerPlex○R16（PP16）試劑盒，二者均包括DNA聯(lián)合索引系統(tǒng) （combined DNA index system，CODIS）中的13個STR基因座（D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO和D7S820），另外各自增加了 D2S1338和 D19S433、Penta E和Penta D基因座。

這17個STR基因座不僅用于法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定和個體識別案件，也是大多數(shù)國家建立DNA數(shù)據(jù)庫所選用的STR基因座。但對越來越多的樣品進(jìn)行STR分型時，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)一些新的等位基因，命名為“offladder”（OL）。產(chǎn)生這種情況的原因可能是不完全重復(fù)或是在重復(fù)結(jié)構(gòu)附近的側(cè)翼序列區(qū)發(fā)生了插入或缺失，如D7S820基因座，在重復(fù)結(jié)構(gòu)GATA下游12個核苷酸處有8、9或10個相鄰的T，在這個側(cè)翼區(qū)內(nèi)發(fā)生的插入或缺失很容易產(chǎn)生 9.1、9.3、10.1和10.3等“OL”等位基因[1]。另有一種情況是新等位基因在等位基因階梯范圍外，甚至落入相鄰的基因座范圍內(nèi)，誤認(rèn)為三等位基因。Valverde等[2]報道D18S51基因座檢測到了12個新的等位基因（28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，40），并一一進(jìn)行了測序驗證。用PP16試劑盒檢測該基因座時，片段長度大于369bp的新的等位基因會落入Penta E基因座范圍內(nèi)，認(rèn)定為Penta E基因座的OL等位基因或三等位基因模式；而用ID試劑盒檢測時，由于等位基因“27”為等位基因階梯中最大的等位基因，因此片段長度大于349bp的等位基因甚至連“OL”也不標(biāo)識。類似的現(xiàn)象在D21S11、D3S1368、SE33基因座也有報道。由此可見，在檢驗過程中存在錯誤判定的風(fēng)險，進(jìn)行親權(quán)鑒定及數(shù)據(jù)庫比對時應(yīng)引起注意。

為增加系統(tǒng)效能，解決諸如非三聯(lián)體親子鑒定、同胞鑒定、失蹤人員認(rèn)定、大型災(zāi)難事故尸體身源認(rèn)定等難題，各法醫(yī)DNA研究機構(gòu)積極尋找新的常染色體STR基因座，美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院（NIST）研制了一套22個新STR基因座與Amelogenin基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系23plex[3-4]，日本學(xué)者構(gòu)建了一組包括10個新的STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)[5]，我國學(xué)者報道了一組包括14個新的STR基因座的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)[6]，珠海科登生物公司生產(chǎn)的STRtyper 10G由9個新的STR基因座與Amelogenin基因座組成[7]。在這些基因座中，除D10S1248、D2S441和 D22S1045被納入歐洲D(zhuǎn)NA數(shù)據(jù)庫核心STR基因座外，其余基因座仍限于實驗室內(nèi)部使用，未列入核心基因座范圍。

1.2 X染色體STR

由于X染色體具有不同于常染色體及Y染色體的特殊的遺傳模式，X染色體上的遺傳標(biāo)記對于父女鑒定、母子鑒定、同胞或半同胞鑒定、隔代鑒定等特殊親權(quán)鑒定案件具有其它遺傳標(biāo)記無可比擬的優(yōu)勢，在法醫(yī)DNA領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多。自1991年首次報道兩個X-STR基因座HPRTB和ARA以來[8]，法醫(yī)DNA領(lǐng)域目前累計報道的X-STR基因座約30余個。

X-STR通常被定義為4個連鎖群[9]，分別以DXS 8378、DXS7132、HPRTB、DXS7423為核心，位于Xp22.2，Xq12，Xq26和Xq28。德國的Biotype公司以這4個核心位點開發(fā)了MentypeArgus X-UL試劑盒，并有學(xué)者對其靈敏度、混合斑分析及擴(kuò)增體系等方面進(jìn)行了評估，認(rèn)為此試劑盒對于解決一些親權(quán)鑒定案件有一定的應(yīng)用潛力[10]。

為進(jìn)一步增加系統(tǒng)效能，Biotype公司又研制了MentypeArgus X-12試劑盒，在MentypeArgus X-8試劑盒的基礎(chǔ)上再加入4個STRs，每個連鎖群內(nèi)包括3個STR基因座組成12個基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系，分別為：DXS10148-DXS10135-DXS8378；DXS7132-DXS10079-DXS10074；DXS10103-HPRTB-DXS10101；DXS10146-DXS10134-DXS7423。目前尚無應(yīng)用此試劑盒進(jìn)行法醫(yī)學(xué)研究和實踐的文獻(xiàn)報道。

盡管X-STR在親權(quán)鑒定方面具有獨特的應(yīng)用價值，但X-STR在法醫(yī)DNA領(lǐng)域的應(yīng)用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于常染色體STR及Y-STR，因此，在X-STR基因座的群體遺傳學(xué)調(diào)查、突變率分析、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值評估、試劑盒的研發(fā)等方面，仍有相當(dāng)大的研究空間。

1.3 Y染色體STR

由于Y染色體STR遺傳標(biāo)記獨特的父系遺傳方式，主要將其應(yīng)用于父子單親鑒定或其他父系血緣關(guān)系的鑒定。在父子單親鑒定中，由于缺乏母親的遺傳信息，父權(quán)排除的概率明顯降低，檢測Y-STR基因座則有助于減少這種錯誤認(rèn)定的機會。Fabricio等[13]報道了1例父子單親鑒定的案例，應(yīng)用Promega公司的PP16及FFFL試劑盒檢測了孩子與兩個假設(shè)父的19個STR基因座，兩個假設(shè)父的父權(quán)指數(shù)分別為13，811.215和35，332.241，均不能排除，直至用PPY試劑盒分析了三者的Y-STR基因座，發(fā)現(xiàn)假設(shè)父1的Y單倍型與孩子不同，將假設(shè)父1排除父權(quán)。另外，在肯定父權(quán)時，聯(lián)合應(yīng)用常染色體STR及Y-STR，可增加父權(quán)指數(shù)，增加認(rèn)定的機會[14]。因此，在進(jìn)行父子單親鑒定時，除檢測常染色體STR外，增加檢測YSTR可大大降低錯判的風(fēng)險。

1.4 SNP

雖然大多數(shù)法醫(yī)學(xué)家認(rèn)為SNP遺傳標(biāo)記在很長一段時間內(nèi)不會取代STR，但由于SNP數(shù)量豐富、突變率低、片段短、能夠提供一些特殊信息、檢測手段多樣等特點，使其成為STR遺傳標(biāo)記的重要補充[15]。目前研究比較成熟的是歐洲SNPforID協(xié)會研制的52 SNP-plex，包含52個處于連鎖平衡狀態(tài)的常染色體SNP基因座，用復(fù)合PCR及微測序法進(jìn)行分型，具體信息可登錄http：//www.snpforid.org網(wǎng)站查詢[16]。B?rsting等[17]對52 SNP-plex系統(tǒng)在親子鑒定中的應(yīng)用價值進(jìn)行了系統(tǒng)評估，用該體系分析了124對真三聯(lián)體，父權(quán)指數(shù)為105～106；父親與孩子二聯(lián)體的父權(quán)指數(shù)為103～104。與15個STR基因座的父權(quán)指數(shù)相比，該SNP體系的父權(quán)指數(shù)低5～50倍。但在這124個案例中，發(fā)現(xiàn)STR基因座有6個突變，SNP基因座無突變，該研究表明52 SNP-plex體系在親權(quán)關(guān)系鑒定中是一個非常有效的系統(tǒng)。在涉及移民的親權(quán)鑒定案件中，往往缺乏父母一方的信息，需要計算父親或母親的親權(quán)指數(shù)，并且需要考慮排除叔侄關(guān)系或姨親關(guān)系。對于這樣的案件，常規(guī)STR檢驗往往不能提供足夠的信息。Ballard等[18]分析了55例移民親權(quán)鑒定案件，用17個常規(guī)STR基因座、6個新加的STR基因座及48個SNP基因座進(jìn)行分析，比較6個STR基因座與48個SNP基因座對常規(guī)STR的補充效能，發(fā)現(xiàn)SNP的應(yīng)用價值更大。Dario[19]應(yīng)用SNPforID中的20個SNP基因座對葡萄牙56例親權(quán)鑒定案件進(jìn)行分析，認(rèn)為這20個SNP基因座對于常規(guī)STR基因座是一個很有效的補充，而且與增加STR遺傳標(biāo)記相比，方法簡單且成本較低。Philip等[20]從統(tǒng)計學(xué)方面也證實，對于復(fù)雜的親權(quán)鑒定案件，補充SNP基因座較STR基因座更有效。

另有學(xué)者報道了用芯片技術(shù)檢測124 SNP-plex，包括46個常染色體SNP基因座、29個Y-SNP及49個mtDNA SNP，即在一次反應(yīng)中就可同時分析3種類型的遺傳標(biāo)記，提供更多的信息，且靈敏度較高，但其準(zhǔn)確性及實用性尚有待進(jìn)一步驗證與評估[21]。

2 STR基因座突變的考慮

STR基因座的突變會明顯干擾親緣關(guān)系的判定。隨著案件積累量的不斷增加，近年來一些學(xué)者相繼報道了常用STR基因座的突變率及對親權(quán)鑒定的影響[22-25]。綜合這些文獻(xiàn)分析，在親權(quán)關(guān)系檢案中，單個STR基因座突變的案例占2%~3%左右，2個STR基因座突變的案例約0.04%。

2.1 突變基因座親權(quán)指數(shù)的計算

對于突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)的計算，陸惠玲教授[26]應(yīng)用經(jīng)驗遞減模型對計算公式進(jìn)行了詳細(xì)解讀，因其計算原理易于理解，計算也較方便，具有實用意義。由于STR基因座突變率約在0～0.7%，平均0.2%，因此考慮突變時，其PI值均低于無突變的情形，提示要檢測更多的遺傳標(biāo)記才能使累積親權(quán)指數(shù)達(dá)到認(rèn)定親權(quán)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 突變案件的分析與解決建議

一般情況，當(dāng)檢測一定數(shù)量的STR基因座而只有少數(shù)幾個基因座排除親子關(guān)系時，就應(yīng)考慮突變的可能性。這里的“一定數(shù)量”和“少數(shù)幾個”是沒有固定標(biāo)準(zhǔn)的，因它受到基因座的多態(tài)性、突變率以及親子關(guān)系認(rèn)定水平等因素影響。在使用PP16和ID系統(tǒng)時，如果能檢出15個STR的基因型，只有≤3個基因座排除親子關(guān)系，就應(yīng)懷疑有突變，因為其它不排除親子關(guān)系的基因座的累積非父排除率仍可達(dá)99%以上[25]。李海霞等曾報道1例3個基因座同時發(fā)生突變的三聯(lián)體鑒定案例[27]。

考慮突變時，應(yīng)該用相同或不同的試劑盒進(jìn)行重復(fù)實驗，保證分型正確。由于STR具有較高的突變率，因此增加STR基因座有可能檢出新的突變[25]。隨著SNP遺傳標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的日益成熟，筆者建議增加突變率較低的SNP遺傳標(biāo)記，或者根據(jù)案件的具體情況增加性染色體遺傳標(biāo)記，如父子關(guān)系鑒定，可檢測Y-STR或Y-SNP；父女關(guān)系鑒定，可檢測X-STR或X-SNP；母子、母女關(guān)系鑒定可檢測XSTR、X-SNP或mtDNA。此外，突變需要與下列3種情況區(qū)分[25]：（1）沉默等位基因；（2）親屬個體代替檢驗；（3）單親二體征，Audrey等[28]曾報道1例21號染色體單親二體征引起的錯誤否定父權(quán)的案例。

3 DNA生物統(tǒng)計計算

2002年，國際法醫(yī)遺傳學(xué)會（International Society for Forensic Genetics，ISFG）親權(quán)鑒定委員會（The Paternity Testing Commission，PTC）按照ISO17025的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)布了關(guān)于遺傳學(xué)調(diào)查的建議書[29]。2007年，PTC發(fā)布了親權(quán)鑒定中生物統(tǒng)計計算的建議書[30]，強烈建議所有親權(quán)鑒定實驗室采用所描述的5條建議作為生物統(tǒng)計計算的基礎(chǔ)。該5條建議的主要內(nèi)容包括：

（1）證據(jù)強度應(yīng)以似然率原則為基礎(chǔ)進(jìn)行計算，親權(quán)關(guān)系的生物統(tǒng)計評估應(yīng)建立在互相排斥的假設(shè)的基礎(chǔ)上。當(dāng)檢測系統(tǒng)中有不符合遺傳規(guī)律的基因座（可能是突變的結(jié)果）時，應(yīng)對檢測個體可能發(fā)生突變的基因座PI值進(jìn)行調(diào)整，計算PI值的方法應(yīng)有文獻(xiàn)出處。在進(jìn)行生物統(tǒng)計計算時，要考慮沉默等位基因發(fā)生的概率。如果只檢測到1個等位基因，就應(yīng)在計算PI時考慮沉默等位基因或無效等位基因的可能。

（2）在群體遺傳學(xué)中，稀有等位基因的概率，可用以下公式進(jìn)行估計：

Xi代表數(shù)據(jù)庫中該基因座已有的等位基因的個數(shù)，N代表等位基因的總數(shù)。

Y-染色體和mtDNA遺傳標(biāo)記的似然率必須以單倍型頻率計算，其遺傳證據(jù)強度需要和常染色體遺傳標(biāo)記證據(jù)聯(lián)合使用。

（3）對于標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體案件和復(fù)雜案件（單親或雙親皆疑），生物統(tǒng)計計算的原則是相同的。所有關(guān)于親權(quán)關(guān)系鑒定的統(tǒng)計計算都是以似然率原則為基礎(chǔ)的，即需要評價兩個相關(guān)的互斥假設(shè)。不管案件多么復(fù)雜，這個原則是不變的。此外，涉及移民案件的生物統(tǒng)計計算也應(yīng)以似然率原則為基礎(chǔ)。

（4）各實驗室負(fù)責(zé)建立并確認(rèn)各自的排除父權(quán)的標(biāo)準(zhǔn)，建議最好以PI閾值定義否定父權(quán)的標(biāo)準(zhǔn)，但也可以不符合遺傳規(guī)律的基因座數(shù)目建立排除標(biāo)準(zhǔn)。

（5）進(jìn)行案例報道時，論文中除了累積PI外，還應(yīng)包括每個遺傳系統(tǒng)各自的PI值，以及實驗室計算所用的種族群體背景資料。如果報道父權(quán)概率（W），則必須指出前概率。當(dāng)用另外的方法計算PI時，還應(yīng)說明該計算方法的假設(shè)、有效性及相應(yīng)的計算機技術(shù)。

[1]李成濤，郭宏，趙珍敏，等.親權(quán)鑒定中常用STR基因座的基因組學(xué)和遺傳學(xué)分析[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（3）：214-220.

[2]Valverde AM，F(xiàn)uente SS，Nun~ez-Rivas G，et al.Characterisation of 12 new alleles in the STR system D18S51[J]. Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：43-44.

[3]Butler JM，Hill CR，Decker AE，et al.New autosomal STR loci[J].Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2008，1（1）：95–96.

[4]Vallone PM，Hill CR，Lewis KE，et al.Uses of the NIST 26plex STR assay for human identity testing[J].Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：29–30.

[5]Asamura H，F(xiàn)ukushima OM.Population data on 10 non-CODIS STR loci in Japanese population using a newly developed multiplex PCR system[J].J Forensic Legal Med，2008，15（8）：519–523.

[6]Shi MS，Yu XJ，Bai RF，et al.Genetic polymorphism of 14 non-CODIS STR loci for forensic use in southeast China population[J].Forensic Sci Int，2008，174（1）：77–80.

[7]Song XB，Tang DJ，Ren R，et al.Genetic polymorphisms of 9 non-combined of DNA index system short tandem repeat loci of Chinese Tibetan ethnic minority group in Tibet[J]. Forensic Sci Int Genet，2010，doi：10.1016/j.fsigen.2010.02.005

[8]Hearne CM，Todd TM，Tetranucleotide repeat polymorphism at the HPRT locus[J].Nucleic Acids Res，1991，19（19）：5450.

[9]Szibor R.X-chromosomal markers：past，present and future[J]. Forensic Sci Int Genet，2007，1（2）；1：93-9.

[10]Gehrig C，Teyssier A.Validation of the Mentype○RArgus XUL kit[J].Int Congress Ser，2006，1288：325–327.

[11]Becker D，Rodig H，Augustin C，et al.Population genetic evaluation of eight X-chromosomal short tandem repeat loci using Mentype Argus X-8 PCR amplification kit[J].Forensic Sci Int Genet，2008，2（1）：69–74.

[12]Acar E，Bulbul O，Rayimoglu G，et al.Optimization and validation studies of the MentypeR○Argus X-8 kit for paternity cases[J].Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：47–48.

[13]Gonza′lez-Andrade F，Sa′nchez D，Penacino G，et al.Two fathers for the same child：A deficient paternity case of false inclusion with autosomic STRs[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（2）：138–140.

[14]魏天莉，李茜，程良紅，等.Y-STR及HLA-A、-B、-DRB1基因分型在二聯(lián)體親子鑒定中的應(yīng)用[J].中國輸血雜志，2009，22（4）：289-291.

[15]Butler JM，Budowle B，Gill P，et al.Report on ISFG SNP Panel Discussion[J].Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2008，1（1）：471–472.

[16]Sanchez JJ，Phillips C，Bsting C，et al.A multiplex assay with 52 single nucleotide polymorphisms for human identification[J].Electrophoresis，2006，27（9）：1713–1724.

[17]B?rsting C，Sanchez J，Hansen H，et al.Performance of the SNPforID 52 SNP-plex assay in paternity testing[J].Forensic Sci Int Genet，2008，2（4）：292-300.

[18]Ballard DJ，Brown EM，Khan L，et al.Supplementary markers for deficient immigration cases：Additional STRs or SNPs?[J] Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：153–154.

[19]Dario P，Ribeiro T，Espinheira R，et al.SNPs in paternity investigation：The simple future[J].Forensic Sci Int Genet Suppl Ser，2009，2（1）：127–128.

[20]Phillips C，F(xiàn)ondevila M，Magarin~os MG，et al.Resolving relationship tests that show ambiguous STR results using autosomal SNPs as supplementary markers[J].Forensic Sci Int Genet，2008，2（3）：198–204.

[21]Krjutsˇkov K，Viltrop T，Palta P，et al.Evaluation of the 124-plex SNP typing microarray for forensic testing[J]. Forensic Sci Int Genet，2009，4（1）：43–48.

[22]Chula FG，Rodenbusch R，Schumacher S，et al.15 STR loci frequencies with mutation rates in the population from Rio Grande do Sul，Southern Brazil[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（2）：e35–e38.

[23]Andrade ES，Gomes EV，Raposo G，et al.Mutation rates at 14 STR loci in the population from Pernambuco，Northeast Brazil[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（4）：e141–e143.

[24]趙珍敏，柳燕，林源.IdentifilerTM系統(tǒng)在親子鑒定中的突變觀察和分析[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（4）：290-291.

[25]呂德堅，陸惠玲.親子鑒定STR突變的考慮[J].中國司法鑒定，2009，（4）：43-45.

[26]陸惠玲，呂德堅.常染色體STR突變基因座父權(quán)指數(shù)計算[J].中國司法鑒定，2009，（4）：32-35.

[27]李海霞，孫宏鈺，張何，等.3個STR基因座同時突變的親子鑒定案1例[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（4）：319-320.

[28]Audrey ML，Jurgen H，Henke L，et al.A paternity case with three genetic incompatibilities between father and child due to maternal uniparental disomy 21 and a mutation at the Y chromosome[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（2）：141–143.

[29]Morling N，Allen R，Carracedo A，et al.Paternity Testing Commission of the International Society of Forensic Genetics：recommendations on genetic investigations in paternity cases[J].Forensic Sci.Int，2002，129（3）：148–157.

[30]Gjertson DW，Brenner CH，Baur MP，et al.ISFG：Recommendations on biostatistics in paternity testing[J].Forensic Sci Int Genet，2007，1（3）：223-231.