林源，趙珍敏，李莉

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

常染色體的STR檢驗(yàn)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于親權(quán)鑒定中，對(duì)檢測(cè)的多個(gè)特定基因座而言，一個(gè)個(gè)體在每個(gè)基因座只能得到2個(gè)等位基因，這2個(gè)等位基因可能相同（純合子）也可能不同（雜合子），分別來(lái)源于其親生父母親。單個(gè)個(gè)體在多個(gè)STR基因座同時(shí)具有2個(gè)以上等位基因的情形極其罕見(jiàn)。本文使用常染色體STR、X染色體STR和Y染色體STR對(duì)一家祖孫三代進(jìn)行DNA分型。

1 材料和方法

1.1 樣本材料

因ABO血型不符（母O型，男孩O型，父AB型），孩子的父親懷疑孩子非自己親生，遂和孩子生母、孩子一起來(lái)本中心進(jìn)行父子親權(quán)鑒定。本中心采集指血備檢，其后為了進(jìn)一步明確孩子父親檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性和嵌合體基因的來(lái)源，再次采集孩子父親的唾液、頭發(fā)和孩子祖父母的血樣備檢。

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA的提取采取Chelex-100法。

1.3 STR擴(kuò)增

1.3.1 常染色體STR擴(kuò)增

采用Goldeneye 20A試劑盒 （北京基點(diǎn)認(rèn)知公司）對(duì)孩子父親的血樣、發(fā)根、唾液以及孩子生母、孩子、孩子祖父母的血樣DNA進(jìn)行常染色體STR基因座的多重PCR擴(kuò)增，STR基因座依次為D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338、FGA。操作按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 Y-STR擴(kuò)增

采用Yfiler試劑盒 （美國(guó)AB公司）對(duì)孩子父親、孩子、孩子祖父母的血樣進(jìn)行Y染色體17個(gè)STR基因座的多重PCR擴(kuò)增，Y-STR基因座依次為DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385 a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、Y GATA H4、DYS437、DYS438和DYS448。操作按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 X-STR擴(kuò)增

采用Xplex-16試劑盒（本實(shí)驗(yàn)室自制）對(duì)孩子父親、孩子祖父母的血樣進(jìn)行16個(gè)X-STR基因座多重PCR擴(kuò)增，16個(gè)X-STR基因座依次為GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810和DXS7132，操作按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與 10 μL Hi-Di甲酰胺-LIZ500混勻，95℃變性3min，通過(guò)ABI 3100-Avant型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，收集電泳信息，然后用GeneMapper 3.2軟件對(duì)各基因座進(jìn)行分型。

2 結(jié)果

2.1 常染色體STR檢測(cè)結(jié)果

采用Goldeneye 20A試劑盒檢測(cè)得到19個(gè)STR基因座，本案中孩子生母、孩子、孩子祖父母的基因型從表1所示結(jié)果中可見(jiàn)，孩子父親在多個(gè)基因座均檢見(jiàn)嵌合基因（圖1 血、發(fā)根、唾液DNA分型結(jié)果一致），這些嵌合基因都可以從孩子祖父母的STR基因型中找到來(lái)源。

2.2 Y-STR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

表1 祖孫三代的常染色體STR檢驗(yàn)結(jié)果

圖1 孩子父親血樣和頭發(fā)的常染色體STR分型圖譜

鑒于孩子父親STR檢驗(yàn)結(jié)果的特殊性，選用Yfiler試劑盒進(jìn)行Y-STR基因座檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明孩子父親和孩子的單倍型相同（圖2）。

2.3 X-STR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

X染色體STR檢測(cè)，孩子祖母在每個(gè)基因座檢見(jiàn)2個(gè)等位基因，孩子祖父在每個(gè)基因座檢見(jiàn)1個(gè)等位基因（表2），而孩子父親在多個(gè)基因座均檢出2-3個(gè)等位基因（圖3），這些等位基因均可從孩子祖父母的DNA表型找到來(lái)源。

3 討論

在DNA檢驗(yàn)中有時(shí)會(huì)遇到極少數(shù)生物樣品在多個(gè)基因座同時(shí)檢出2個(gè)以上等位基因的情形，它多見(jiàn)于混合樣品、樣品受到外源性污染或是骨髓移植后病人血樣等。對(duì)于親權(quán)鑒定實(shí)踐中觀察到的混合基因應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)，以消除出現(xiàn)樣品污染的可能性并驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。本案例中孩子父親的血樣、頭發(fā)根、唾液均檢見(jiàn)完全一致的嵌合基因，排除了孩子父親樣品被污染的可能性；孩子父親在每個(gè)STR基因座可分別檢出2-4個(gè)等位基因，一些基因座出現(xiàn)擴(kuò)增不均衡現(xiàn)象，應(yīng)為相同大小等位基因的疊加，表明其血樣、頭發(fā)根、唾液中均存在2種不同細(xì)胞系的嵌合。Y-STR檢驗(yàn)可得到其單倍型，X-STR檢驗(yàn)可在不同基因座檢出1-3個(gè)等位基因，判定孩子父親的細(xì)胞系中存在3條X染色體和1條Y染色體，同時(shí)存在XX、XY性別基因。該嵌合體可涉及任何一條染色體的畸變，通常發(fā)生在受精卵形成后的卵裂或胚胎正常發(fā)育早期。在胚胎發(fā)育的不同階段如果發(fā)生了突變，可以產(chǎn)生組織部分性和全身性嵌合體，本案中孩子父親表現(xiàn)為全身性嵌合。

圖2 孩子和孩子父親血樣的Y染色體STR分型圖譜

圖3 孩子父親血樣的X染色體STR分型圖譜

表2 孩子祖父母和孩子父親的X染色體STR檢驗(yàn)結(jié)果

孩子祖父母和孩子父親的親權(quán)鑒定結(jié)果表明，孩子父親在常染色體的嵌合基因都能夠從孩子祖父母的基因型中找到來(lái)源；與一般男性僅可檢出來(lái)源于母親的X-STR單倍型不同，孩子父親可同時(shí)檢出來(lái)源于孩子祖父母的3條X-STR染色體的混合基因。

雖然，父母和孩子的ABO血型不符合遺傳規(guī)律，但進(jìn)一步分析父母和孩子的親權(quán)鑒定結(jié)果，孩子父親和孩子Y染色體STR的檢驗(yàn)結(jié)果完全相同 （來(lái)源于同一父系），孩子父親常染色體STR嵌合的檢驗(yàn)結(jié)果符合作為孩子生父的遺傳基因條件，支持孩子父親為孩子的生物學(xué)父親。

[1]吳堅(jiān)柱，謝英俊，陳寶江，等.產(chǎn)前診斷中羊水嵌合體形成機(jī)制的探討[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18（11）：59-61.

[2]高淑英，司艷梅，薛虹，等.關(guān)于產(chǎn)前診斷絨毛細(xì)胞和羊水細(xì)胞中嵌合現(xiàn)象［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15（11）：11.