閆李俠，黃至澄，徐黔寧，陳保文，王國治

(1、臺(tái)州市第一人民醫(yī)院，浙江臺(tái)州 318020；2、中國藥品生物制品檢定所 100050)

54株分枝桿菌國際參考株16S rRNA序列分析

閆李俠1，黃至澄1，徐黔寧1，陳保文2，王國治2

(1、臺(tái)州市第一人民醫(yī)院，浙江臺(tái)州 318020；2、中國藥品生物制品檢定所 100050)

目的分析54株分枝桿菌國際參考株16S rRNA序列，為臨床分離株的鑒定提供參考。方法用16S rRNA序列分析法對(duì)54株分枝桿菌國際參考株進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，計(jì)算相似性百分比。結(jié)果除11株(共9種4組)分枝桿菌，即產(chǎn)鼻疽分枝桿菌與塞內(nèi)加爾分枝桿菌；潰瘍分枝桿菌與海分枝桿菌；堪薩斯與胃分枝桿菌；3株結(jié)核分枝桿菌與田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌16S rRNA基因序列完全相同無法相互鑒別，其它41株(共41種)分枝桿菌菌種間16S rRNA均不相同可以得到很好的鑒別。結(jié)論16S rRNA基因序列分析是一種很好的鑒定分枝桿菌的方法，國際參考株16S rRNA基因序列的研究彌補(bǔ)了基因數(shù)據(jù)庫的不足。

分枝桿菌；16S rRNA；序列分析

rRNA基因被稱為細(xì)菌的“活化石”，是目前細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類與鑒定的最常用靶基因。rRNA基因存在染色體上，包括長約1.6kb的16S，3.3kb的23S，0.12kb的5S基因。由于16S rRNA基因的長度適中，并且高變區(qū)序列具有細(xì)菌屬、種的特征，因而16S rRNA基因的序列測(cè)定已作為細(xì)菌分類和鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。但16S rRNA基因序列分析定要想成為一種臨床檢測(cè)的常規(guī)方法，還需要一個(gè)強(qiáng)大的質(zhì)控序列數(shù)據(jù)庫[2，3]；而目前的數(shù)據(jù)庫還不夠完善，甚至數(shù)據(jù)庫的有些信息是錯(cuò)誤的[4]，這在一定程度上限制了分子鑒定技術(shù)的臨床應(yīng)用性。分枝桿菌國際參考株為國內(nèi)外分枝桿菌研究的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照株，起實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制作用。但到目前為止尚無54株國際參考株16S rRNA基因的系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究的目的在于分析54株國際參考株16S rRNA基因序列以補(bǔ)充基因庫中尚未公布的部分分枝桿菌基因，為實(shí)現(xiàn)16S rRNA基因分析方法的常規(guī)性提供了重要的基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株：實(shí)驗(yàn)所用國際參考菌株54株均由ATCC引進(jìn)并在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心保藏。

1.1.2 PCR引物和測(cè)序引物：上游引物(位于分枝桿菌 16Sr RNA 基因的 62～85 位核苷酸)：5′-CAC ATG CAA GTC GAA CGG AAA GG-3′下游引物(位于分枝桿菌 16S rRNA 基因 626～647位核苷酸)：5′-GCC CGT ATC GCC CGC ACG CT-3′。上下游引物擴(kuò)增16S rRNA基因5′端～585bp片段，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。引物均由上海英俊生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備 將實(shí)驗(yàn)菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，慢生長分枝桿菌37℃或28℃培養(yǎng)2～3周，快生長分枝桿菌培養(yǎng)5～7d。將培養(yǎng)物混懸于1ml 0.9%生理鹽水中，12000r/min離心5min棄上清，加入 200μl TE 緩沖液，100℃煮沸 15min，12000 r/min4℃離心20min，取含有DNA的上清液置于另一滅菌EP管中于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 在50μl反應(yīng)體系內(nèi)PCR擴(kuò)增，10×PCR buffer 5μl，上游引物和下游引物終濃度各0.2μmol/L，4 ×dNTP 終 濃 度 各 為 0.2mmol/L，rTaq DNA聚合酶2U，DNA模板10～15ng，加雙蒸水至50μl。94℃預(yù)變性 5min，擴(kuò)增條件 94℃ 1min，64℃1 min，72℃ 1min，共 30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 7min。

1.2.3 DNA純化與測(cè)序 使用Takara公司生產(chǎn)的DV805A純化試劑盒回收純化目的DNA、所有DNA樣品送上海生工生物工程公司做上、下游測(cè)序并將雙向結(jié)果拼接后得到最準(zhǔn)確序列。

1.2.4 核苷酸序列分析 對(duì)所測(cè)定序列用Clustalx 1.83軟件進(jìn)行同源性多序列比對(duì)，并用鄰位相連法(Neighbour Joining,N-J法)繪制16S rRNA基因序列聚類分析樹狀譜，使用DNAStar的MegAlign軟件計(jì)算相似性百分比。

2 結(jié)果

2.1 54株分枝桿菌參考株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增：成功完成54株分枝桿菌的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，均得到一約585bp的16S rRNA 5′端DNA片段，與目的條帶大小相符，見圖1。

圖1 分枝桿菌16S rRNA基因5′端PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 分枝桿菌參考株16S rRNA基因5′端DNA多序列比對(duì)

圖3 依據(jù)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株16S rRNA基因構(gòu)建的聚類分析樹狀譜

圖4 54株分枝桿菌參考株之間的相似性百分比

2.2 54株分枝桿菌參考株16S rRNA基因序列測(cè)定：完成54株分枝桿菌16S rRNA基因的上、下游序列測(cè)定，得到其雙向拼接結(jié)果。

2.3 54株分枝桿菌之間16S rRNA基因序列分析：通過54株分枝桿菌之間同源性序列比對(duì) (見圖2)，繪制16S rRNA基因序列聚類分析樹狀譜 (見圖3)，計(jì)算株間相似百分比(見圖4)。發(fā)現(xiàn)其中11株分枝桿菌，即產(chǎn)鼻疽分枝桿菌(95012)與塞內(nèi)加爾分枝桿菌 (95041)；潰瘍分枝桿菌 (95004)與海分枝桿菌(95014)；堪薩斯分枝桿菌 (95013)與胃分枝桿菌(95006)；3株結(jié)核分枝桿菌 (95052)(95053)(95054)與田鼠分枝桿菌 (95048)、非洲分枝桿菌(95049)16S rRNA基因序列完全相同無法鑒別，各組對(duì)之間相似性百分比為100%，其它43株分枝桿菌16S rRNA核苷酸序列長度及排列具有較高變異性，16S rRNA基因相似性百分比為91.7%～99.6%，所測(cè)定分枝桿菌的16S rRNA基因5′端既含有屬特異的保守區(qū)域，又含有兩個(gè)種特異的高變區(qū)，分別位于第60～170位核苷酸和位于第340～430位核苷酸區(qū)域。

3 討論

由于16S rRNA基因的長度適中，并且高變區(qū)序列具有細(xì)菌屬、種的特征，因而16S rRNA基因的序列測(cè)定已作為細(xì)菌分類和鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究中16S rRNA基因序列分析可以對(duì)大部分分枝桿菌種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，不足之處在于分枝桿菌種間16S rRNA基因多態(tài)性相對(duì)較低，常常無法區(qū)分某些親緣關(guān)系密切的種或同一菌種內(nèi)的不同菌株，如研究中報(bào)道16S rRNA基因無法區(qū)分堪薩斯與胃分枝桿菌；塞內(nèi)加爾與產(chǎn)鼻疽分枝桿菌；海與潰瘍分枝桿菌；MTC各成員[5，6]。要想對(duì)上述11株16S rRNA基因序列相互之間完全相同的分枝桿菌加以鑒別可能還要探索其他更有效的方法。

16 S rRNA基因序列分析與傳統(tǒng)生化方法相比GC和HPLC可以做到快速鑒定，但是兩者都需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，檢測(cè)結(jié)果依賴于分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)的生長狀態(tài)，容易受不同溫度，不同培養(yǎng)基的影響，結(jié)果分析通常比較困難。16S rRNA基因分析并不需要標(biāo)準(zhǔn)的生長狀態(tài)，其更準(zhǔn)確，更實(shí)用。文獻(xiàn)上報(bào)道[7]GC和HPLC不能鑒別M.triplex和 M.fortuitum，M.chelonae 和 M.abscessus，M.avium 和 M.intracellulare，在我們的研究中16S rRNA基因序列分析可以將其鑒別。

54 株國際參考株16SrRNA基因分析結(jié)果表明，該序列分析能將MTC和NTM相鑒別，將大部分NTM鑒定至種的水平。除16S rRNA基因外，近年來16S-23S rRNA ITS用于細(xì)菌菌種鑒定的研究也越來越多。在黃至澄[9]等的研究報(bào)道中16S-23S rRNA ITS序列分析不能鑒別灰塵(95030)與微黃分枝桿菌(95040)；田野(95043)與千田分枝桿菌(95046)；抗熱(95025)與副偶然分枝桿菌(95036)；奧布(95035)與母牛結(jié)核分枝桿菌(95051)；杜氏(95029)與豬分枝桿菌(95039)；金色(95027)與東海分枝桿菌(95038)。而在我們的研究中16S rRNA基因序列分析可以將其很好的鑒別，說明16S rRNA基因與16S-23S rRNA ITS是在不同水平上提供細(xì)菌種系發(fā)育鑒別的兩個(gè)靶基因。兩個(gè)靶基因結(jié)合分析可以將54株國際參考株的大部分分枝桿菌鑒別開，本研究進(jìn)一步證實(shí)此方法的可靠性和實(shí)用性。

16 S rRNA基因分析要想成為一種臨床檢測(cè)的常規(guī)方法，還需要一個(gè)強(qiáng)大的質(zhì)控序列數(shù)據(jù)庫；而目前的數(shù)據(jù)庫還不夠完善，甚至數(shù)據(jù)庫的有些信息是錯(cuò)誤的。GenBank中也只能查到部分分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的16S rRNA基因序列，這在一定程度上限制了分子鑒定技術(shù)的臨床應(yīng)用性。國際參考株為國內(nèi)外分枝桿菌研究的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照株，起實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制作用。但到目前為止尚無54株國際參考株16S rRNA基因的系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究為實(shí)現(xiàn)16S rRNA基因分析方法的常規(guī)性提供了重要的基礎(chǔ)條件。54株國際參考株為中國藥品生物制品檢定所收藏株，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株16S rRNA基因序列研究與公布為實(shí)現(xiàn)國家醫(yī)學(xué)微生物資料共享試點(diǎn)中分枝桿菌資源共享邁出第一步。

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Analysis of the genotype in 54 reference strains of Mycobacteria based on 16S rRNA gene sequences

YAN Lixia,HUANG Zhicheng,XU Qianning,et al.Taizhou First People's Hospital,Zhejiang Taizhou 318020,China

ObjectiveTo analyze the genotype in 54 reference strains of mycobacteria for the identification of clinical isolates.MethodsThe genotypes in 54 reference strains of mycobacteria were analyzed with 16S rRNA sequence,then phylogenetic tree was constructed and similarity was calculated.ResultsWith the sequencing of 16S rRNA in the 54 reference strains of mycobacteria,all the mycobacteria could be discriminated except M.farcinogenes and M.senegalense;M.ulcerans and M.marinum;M.gastri and M.kansasii;3 strains of M.tuberculosis and M.microti,M.africanum.Conclusions 16S rRNA gene sequence analysis is a reliable method to discriminate mycobacteria.The study of the genotype in 54 reference strains of Mycobacteria is compensation for Gene database.

Mycobacteria；16S rRNA；Reference strains

R378.91,R446.5

A

1674-1129(2011)05-0469-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.05.003

國家科技重大專項(xiàng)課題，編號(hào)：2009ZX10004-805

閆李俠，女，1981年1月生，畢業(yè)于蘭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，碩士研究生，臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)專業(yè)，主管檢驗(yàn)師，研究方向：微生物與分子生物學(xué)。