何瑞雪，高文宏，曾新安，朱思明

1(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)2(廣州現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術研究院，廣東廣州，511458)

抗氧化與人類的健康密切相關，有關研究表明，各種自由基如羥基自由基、超氧陰離子自由基等所引發(fā)的氧化作用是導致身體中各組織器官損傷、病變的重要原因之一，人類許多疾病如癌癥、心臟病、衰老過程等均與自由基造成的氧化損傷、脂質(zhì)過氧化、抗氧化酶活力降低等有關［1－6］，抗氧化活性物質(zhì)能清除自由基并保護人體健康。此外，強致癌物質(zhì)亞硝胺的前體亞硝酸鹽大量存在于食物中及產(chǎn)生于食物在體內(nèi)的代謝過程中，因此，阻斷亞硝胺合成或消除亞硝胺的前體是預防癌癥的有效途徑之一［7］。

近年來，多糖鐵配合物成為研究熱點，它具有副作用小、易吸收等優(yōu)點，符合理想的口服補鐵劑的國際標準，是一類值得研究開發(fā)的新型補鐵劑［8］。豆制品副產(chǎn)物豆渣中含有大量SSPS(水溶性大豆多糖)，具有多種生物活性，如膳食纖維功能、抗氧化性、乳化及乳化穩(wěn)定性等，是一種天然的功能性成分［9］，作為廉價易得的原料，對其與Fe3+配合后得到的SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的研究具有重要意義。本文以SSPS為原料，用檸檬酸三鈉-三氯化鐵法［10］合成SSPS-Fe(Ⅲ)配合物，并對SSPS與鐵配合前后的抗氧化性質(zhì)進行了研究，以期得到一種具有多種生物活性的新型補鐵劑或強化鐵的食品添加劑。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料與試劑

水溶性大豆多糖(江蘇欣瑞食品科技發(fā)展有限公司，純度≥80%，水分≤7.0%，粗蛋白質(zhì)≤8.0%，粗灰分≤10.0%);大豆卵磷脂;鄰菲羅啉、鹽酸、鹽酸羥胺、醋酸鈉、亞鐵氰化鉀、抗壞血酸、氫氧化鈉、三氯化鐵、檸檬酸三鈉、硫酸亞鐵、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、水楊酸、雙氧水、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;TGL-20bR型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;85-2恒溫磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司;KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;1835烏氏毛細管黏度計，上海隆拓儀器廠。

2 實驗方法

2.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的制備

稱取水溶性大豆多糖 1.920 g、檸檬酸三鈉1.000 g，用100 mL蒸餾水溶解，置于69.7℃水浴中攪拌，同時緩慢滴加2 mol/L的三氯化鐵溶液和0．2 g/mL的NaOH溶液，保持反應液pH 8.89，當產(chǎn)生紅棕色不溶物時停止滴加三氯化鐵溶液和氫氧化鈉溶液，繼續(xù)水浴攪拌1.41h，冷卻后離心，上清液用無水乙醇醇析，醇析所得沉淀分別用體積分數(shù)95%乙醇、無水乙醇、無水丙酮洗滌，真空干燥后得 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物。

2.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的理化性質(zhì)測定

2.2.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物含鐵量的測定

采用鄰菲羅啉分光光度法測定SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的含鐵量，標準曲線的繪制參見文獻［11］。準確稱取2.1所得的SSPS-Fe(Ⅲ)配合物0.025g，蒸餾水溶解后定容于50 mL容量瓶中，準確移取0.50 mL溶液于25 mL比色管中，加入10%的HCl 0.5 mL，10%的鹽酸羥胺1 mL，放置30 min，再加入0.15%鄰菲羅啉顯色液2 mL和10%醋酸鈉溶液5 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，顯色10 min后，于510 nm處測定吸光度值A。根據(jù)回歸方程計算Fe(Ⅲ)含量。

2.2.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的穩(wěn)定性

取少量SSPS-Fe(Ⅲ)配合物溶于水，慢慢滴加亞鐵氰化鉀溶液，振蕩試管，觀察現(xiàn)象。

2.2.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的水解

將 FeCl3、FeSO4、SSPS-Fe(Ⅲ)分別溶于蒸餾水，配制成濃度為0.01 mol/L的鐵溶液［SSPS-Fe(Ⅲ)中Fe濃度為0.01 mol/L］，準確量取3種溶液各20 mL，分別用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液滴定，同時用酸度計測定溶液的pH值，觀察現(xiàn)象。

2.2.4 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物黏度的測定

分別配制濃度為10 mg/mL的SSPS-Fe(Ⅲ)溶液及SSPS溶液，以0.8mm烏氏毛細管黏度計30℃常規(guī)測定。

2.2.5 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的還原性［12］

配制0.5 mg/mLSSPS-Fe(Ⅲ)溶液，取10 mL移入100 mL容量瓶中，分別取4份，然后各加入1%抗壞血酸溶液 1、2、3、4 mL，再加入 5 mL 0.15% 的鄰菲羅啉溶液及5 mL 10%的醋酸鈉溶液，用純水定容至刻度，搖勻，在37℃下水浴反應，分別在不同反應時間點取樣，以不加SSPS-Fe(Ⅲ)的溶液為空白，在510 nm波長處測定吸光度值A。

2.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的抗氧化活性測定

2.3.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對羥基自由基的清除活性［13］

25 mL比色管中依次移取5 mL2 mmol/L硫酸亞鐵溶液和5 mL6 mmol/L雙氧水，混合均勻后用6 mmol/L水楊酸溶液定容至刻度，搖勻后立即測A0值。在A0值測定體系中，加入1 mL樣品溶液，搖勻后立即測A1值，以不加水楊酸溶液為樣品空白，測定A10值。清除率可根據(jù)下式進行計算:

2.3.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對亞硝酸鹽的清除活性

亞硝酸鹽清除率的測定采用鹽酸萘乙二胺法:參照文獻［14］的方法，平行做3次求平均值，同時做空白對照實驗。

其中:A0為未加樣液時NaNO2的吸光度(以不加樣液及NaNO2的試劑空白為參比溶液)，A為加入樣液后NaNO2的吸光度(以不加NaNO2，加入樣液的試劑為參比溶液)。

2.3.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對脂質(zhì)抗氧化的活性

脂質(zhì)體的制備:稱取20 mg卵磷脂溶入5 mL的0.05 mol/L(pH 7.4)的磷酸緩沖液中，在超聲發(fā)生器中超聲處理，直至脂質(zhì)體完全溶解，所得液體為單層小體積脂質(zhì)體，置于0℃條件下保存。

脂質(zhì)過氧化的測定方法:參照文獻［15］的方法，平行做3次，計算樣品對脂質(zhì)體過氧化的抑制率。

其中:A模為模型管的吸光度(以不加FeSO4為參比溶液)，A樣為樣品管的吸光度(以不加FeSO4為參比溶液)。

3 結果與分析

3.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的理化性質(zhì)

3.1.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的含鐵量

由標準曲線 A=0.199 67c－0.000 17，R2=0.999 97得配合物含鐵量為18.1%(其中A為吸光度值，c為鐵離子濃度mg/L)。

3.1.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的穩(wěn)定性

在SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的水溶液中滴入亞鐵氰化鉀溶液，結果不顯示Fe3+的特征反應，表明游離的Fe3+濃度極小，不能被檢測出來，說明Fe3+基本上形成了SSPS-Fe(Ⅲ)的穩(wěn)定配合物。

3.1.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的水解

FeCl3開始渾濁時的pH值為2.65，出現(xiàn)大量渾濁時的pH值為6.72;FeSO4開始渾濁時的pH為3.35，出現(xiàn)大量渾濁時的pH為6.79;SSPS-Fe(Ⅲ)配合物在pH 1～14內(nèi)不沉淀。

3.1.4 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的黏度

SSPS與鐵配合后特性黏度增大(見表1)，表明多糖與鐵形成配合物后，分子質(zhì)量增大、分子形狀發(fā)生改變或分子內(nèi)部松散度增大而使黏度增大。

表1 配合物的特性黏度

3.1.5 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的還原性

由圖1可知，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物中的鐵的溶出量及還原速度受加入還原劑抗壞血酸量的影響，隨著抗壞血酸加入量的增加，鐵的溶出量及還原速度都逐漸增大，從1 mL到3 mL，溶出量及還原速度急劇增大，4 mL后增加不大，在5.5 h左右基本達到平衡。

圖1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的還原性

3.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物的抗氧化活性

3.2.1 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對羥基自由基的清除活性

SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS對羥基自由基的清除率如圖2所示。SSPS與SSPS-Fe(Ⅲ)對羥基自由基都有清除活性，活性隨著濃度的增加而增大，且SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對羥基自由基的清除活性比SSPS大得多。在濃度為10 mg/mL時，SSPS對羥基自由基的清除率為16.0%，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對羥基自由基的清除率為29.6%

圖2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS對羥基自由基的清除活性

3.2.2 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對亞硝酸鹽的清除活性

SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS對亞硝酸鹽的清除率見圖3。由圖3可以看出，SSPS與SSPS-Fe(Ⅲ)對亞硝酸鈉都有清除活性，活性隨著濃度的增加而增大，且SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對亞硝酸鈉的清除活性比SSPS大。在濃度為10 mg/mL時，SSPS對亞硝酸鹽的清除率為53.9%，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對亞硝酸鹽的清除率為67.5%，

圖3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS對亞硝酸鈉的清除活性

3.2.3 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對脂質(zhì)抗氧化的活性

SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS對脂質(zhì)過氧化的抑制作用如圖4所示。由圖4可知，SSPS與SSPS-Fe(Ⅲ)對脂質(zhì)過氧化都有抑制作用，隨著濃度的增加抑制作用增強，且SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對脂質(zhì)過氧化的抑制作用明顯高于SSPS。在濃度為10 mg/mL時，SSPS對脂質(zhì)體氧化的抑制率為34.9%，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物對脂質(zhì)體氧化的抑制率為77.9%。

圖4 SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS抑制脂質(zhì)過氧化的能力

4 結論

(1)采用檸檬酸三鈉-三氯化鐵法合成了SSPSFe(Ⅲ)配合物，F(xiàn)e3+與SSPS基本上形成了穩(wěn)定的配合物，且在pH值1～14內(nèi)不沉淀，其特性黏度比SSPS大，含鐵量為18.1%，配合物中鐵的溶出量及還原速度受加入還原劑抗壞血酸量的影響，隨著抗壞血酸加入量的增加，鐵的溶出量及還原速度都逐漸增大，可根據(jù)人體內(nèi)食物的消化特性補充一定量的抗壞血酸使SSPS-Fe(Ⅲ)更好地消化吸收。

(2)對SSPS-Fe(Ⅲ)配合物及SSPS的抗氧化活性的研究表明，SSPS與鐵配合后，對羥基自由基、亞硝酸鹽的清除活性及對脂質(zhì)抗氧化的活性均比SSPS好，因此，SSPS-Fe(Ⅲ)配合物有望成為一種具有多種生物活性的新型補鐵劑或強化鐵的食品添加劑。

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