王浩豪，戴軍，陳尚衛(wèi)，朱松

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

靈芝［Ganoderma lucidum(leyss．ex．fr．)karst］是真菌門(mén)，擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬的真菌，是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兩用真菌［1－2］。廣義上的靈芝包括靈芝屬的所有種類(lèi)，狹義上則指最常見(jiàn)的赤芝品種［3］。靈芝孢子(Ganoderma lucidumspore，一般來(lái)源于赤芝)是其子實(shí)體成熟期從菌蓋彈射出來(lái)的靈芝種子，凝聚了靈芝的精華。由于現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)靈芝確具有顯著的抗衰老、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功效［4－9］，加之我國(guó)悠久的靈芝文化傳承，故近年來(lái)有關(guān)靈芝及靈芝孢子粉的研究和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)十分火熱。但因缺乏科學(xué)有效的檢測(cè)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，大量人工培育生產(chǎn)的靈芝孢子粉、子實(shí)體和菌絲體及其加工產(chǎn)品的質(zhì)量良莠不齊，難以對(duì)其進(jìn)行有效控制和鑒別［10－13］。因此，本文擬針對(duì)靈芝孢子粉的主要功效成分——多糖類(lèi)物質(zhì)，根據(jù)其部分水解產(chǎn)物與組成及結(jié)構(gòu)相關(guān)(組成及結(jié)構(gòu)又與其活性和質(zhì)量相關(guān))的思路和多糖大分子難以直接高效分離和檢測(cè)的特點(diǎn)，首次采用部分酸水解耦合柱前PMP衍生化－反相HPLC［14］分析方法檢測(cè)和表征其特性，通過(guò)若干有代表性的不同來(lái)源的靈芝孢子粉及其他不同部位和不同品種的靈芝類(lèi)樣品中多糖組分的指紋分析研究，構(gòu)建了靈芝孢子粉多糖的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，比較了不同部位和不同品種的靈芝類(lèi)樣品中多糖組分的指紋特征及差異，以期用于實(shí)際樣品的質(zhì)量監(jiān)控和鑒別檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1． 1 儀器與試劑

1．1．1 儀器

Agilent1100液相色譜系統(tǒng)，全自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器(DAD);Agilent1100色譜工作站。

1．1．2 試劑及樣品

單糖標(biāo)準(zhǔn)品:葡萄糖(Glc，99%)、甘露糖(Man，99%)、半乳糖(Gal，≥99%)，均購(gòu)于上海化學(xué)試劑公司;鼠李糖(Rha，≥99%)、巖藻糖(Fuc，≥99%)、葡萄糖醛酸(GlcUA，≥99%)、半乳糖醛酸(GalUA，≥97%)，均為美國(guó) Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;木糖(Xyl，98%)、氨基葡萄糖(GlcN，98%)、氨基半乳糖(GalN，99%)，均為美國(guó) ACROS ORGANICS公司產(chǎn)品;核糖(Rib，＞99．0%)、阿拉伯糖(Ara，99%)，均購(gòu)于廈門(mén)星隆達(dá)生化試劑有限公司。衍生化試劑:1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮(PMP)，純度99%(美國(guó)Acros Organics公司);乙腈，HPLC級(jí)(美國(guó) Tedia公司);三氟乙酸(TFA)，純度不低于99%(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。水，超純級(jí);其它試劑均為分析純。

靈芝孢子粉樣品:15個(gè)批號(hào)分別采自山東、安徽、福建、吉林、湖北、浙江等不同產(chǎn)地。

1． 2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 靈芝孢子粉多糖的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取破壁靈芝孢子粉樣品2g于250 mL三角瓶中，加入150 mL超純水，于水浴70℃超聲50 min(功率300 W)，冷卻后離心，殘?jiān)蒙倭砍兯礈觳㈦x心后，將2次上清液合并，超純水透析24 h，55℃真空濃縮近干，加超純水溶解并定容至10 mL，待測(cè)。

1．2．2 多糖部分酸水解

吸取500μL上步所得的粗多糖水溶液于5 mL的具塞刻度試管中，加入500 μL的0．5 mol/L三氟乙酸(TFA)，充N(xiāo)2封管，沸水浴100℃水解1 h;冷卻后打開(kāi)蓋，真空干燥或加入等體積甲醇后用N2吹干，以去除TFA，再加1 mL超純水溶解水解產(chǎn)物，備用。

1．2．3 PMP 衍生化

取水解后的樣品液(或混合單糖標(biāo)液，各單糖質(zhì)量濃度均為0．3 g/L 左右)100μL，與100μL 0．6 mol/L的NaOH溶液混勻。取其混合液50μL于5mL具塞試管中，再加50μL 0．5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻，同樣在70℃的烘箱中反應(yīng)100 min，取出放置冷卻至室溫;加60μL 0．3 mol/L的HCl中和，加水至1 mL，再加等體積1mL的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0．45μm微孔膜過(guò)濾后供HPLC進(jìn)樣分析。

1．2．4 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm ×4．6 mm i．d．，5μm;流動(dòng)相:0．1 mol/L 磷酸鹽(pH 6．7)緩沖液-乙腈 (體積比為82∶18);柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;流速:0．8 mL/min;進(jìn)樣體積:50μL。

2 結(jié)果與討論

2． 1 方法學(xué)考察

2．1．1 糖對(duì)照品分析

靈芝孢子粉多糖部分酸水解后產(chǎn)生較多的單糖組分(見(jiàn)表1和圖2)，為定性指紋圖譜中這些單糖峰，選取天然多糖中常見(jiàn)的12種單糖制備成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析得到色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，12種單糖分離較好，完全能滿足指紋圖譜定性要求。

圖1 12種單糖-PMP衍生物的HPLC圖譜

2．1．2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取經(jīng)提取、水解和衍生化處理后的13號(hào)靈芝孢子粉多糖樣品溶液在室溫下保存，分別于0，5，10，15，20，25h測(cè)定，對(duì)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(以葡萄糖的保留時(shí)間為參照)和相對(duì)峰面積(占總峰面積百分比)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD＜3%，表明靈芝孢子粉多糖的指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)符合要求。

2．1．3 儀器精密度

取經(jīng)提取、水解和衍生化處理后的13號(hào)靈芝孢子粉多糖樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，對(duì)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(以葡萄糖的保留時(shí)間為參照)和相對(duì)峰面積(占總峰面積百分比)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD＜3%，表明靈芝孢子粉多糖的指紋圖譜精密度試驗(yàn)符合要求。

2．1．4 方法重復(fù)性

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取13號(hào)靈芝孢子粉樣品5份，按照上述提取、水解和衍生化方法平行處理樣品，并在同樣的上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，對(duì)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(以葡萄糖的保留時(shí)間為參照)和相對(duì)峰面積(占總峰面積百分比)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明靈芝孢子粉多糖的指圖譜重現(xiàn)性試驗(yàn)符合要求。

2． 2 靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜指紋圖譜

取各供試品溶液50μL，注入高效液相色譜儀，記錄1h的色譜圖。以葡萄糖的峰為參照峰(S峰)，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見(jiàn)表1。

表1 靈芝孢子粉多糖部分酸水解產(chǎn)物的PMP衍生物特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積范圍

根據(jù)15批供試品溶液HPLC譜給出的相關(guān)參數(shù)，比較供試品譜圖，其中19個(gè)峰是各批供試品所共有的，因此確定19個(gè)峰為共有指紋峰，且共有峰總面積占總峰面積的95%以上。在共有指紋峰中，2號(hào)、15號(hào)(s峰)、16號(hào)和19號(hào)峰的峰面積大于總峰面積的5%(見(jiàn)表1)。各共有峰均按其相對(duì)保留時(shí)間定性，可知圖1中2號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、10號(hào)、14號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、17號(hào)、18號(hào)、19號(hào)峰分別為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，12號(hào)峰為二糖，3號(hào)、9號(hào)峰為三糖。

將色譜圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入指紋圖譜專(zhuān)用軟件中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版(見(jiàn)圖2)。以批號(hào)為1的藥材的指紋圖譜作為參照譜圖，以中位數(shù)法生成15批藥材的對(duì)照用指紋圖譜，得到靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜指紋圖譜，見(jiàn)圖3。

圖2 15個(gè)靈芝孢子粉多糖樣品的HPLC圖譜

圖3 靈芝孢子粉多糖樣品的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

2． 3 15個(gè)靈芝孢子粉多糖樣品色譜指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版對(duì)15批靈芝孢子粉多糖的指紋圖譜進(jìn)行分析，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)地不同批次產(chǎn)品間的相似度較高，大于0．97;不同產(chǎn)地產(chǎn)品間的相似度較低，但仍然大于0．8。

2． 4 不同部位及不同品種靈芝多糖樣品與靈芝孢子粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的比較

用同樣的方法對(duì)不同部位及不同品種靈芝多糖樣品進(jìn)行分析后，得到它們的PMP-HPLC圖譜，見(jiàn)圖4。將它們與赤芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比較，可以發(fā)現(xiàn)有顯著差別:赤芝子實(shí)體多糖圖譜4(a)中木糖和阿拉伯糖的相對(duì)峰面積均大于總峰面積的11%，而標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中這2個(gè)峰的峰面積在0．5%～5%左右。紫芝孢子粉多糖圖譜4(b)中葡萄糖峰的相對(duì)峰面積大于總峰面積的65%，與靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜顯著不同。紫芝子實(shí)體多糖圖譜4(c)與靈芝孢子粉多糖的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比，共有特征峰個(gè)數(shù)明顯不足。這些結(jié)果表明，不同部位及不同品種的靈芝類(lèi)產(chǎn)品的指紋圖譜特征會(huì)有較大的差異，這些差異可作為區(qū)別赤芝孢子粉與其他不同部位及不同品種的靈芝產(chǎn)品的主要依據(jù)之一。

圖4 不同部位及不同品種靈芝樣品的多糖PMP-HPLC圖譜

3 結(jié)論

首次利用部分水解耦合PMP/RP-HPLC的分析技術(shù)，從糖組成、特征水解片段的結(jié)構(gòu)特性角度，對(duì)靈芝多糖進(jìn)行檢測(cè)和表征，通過(guò)15個(gè)不同來(lái)源的有代表性的靈芝孢子粉樣品中多糖組分的指紋分析，構(gòu)建了靈芝孢子粉多糖的HPLC指紋圖譜。此指紋分析方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可作為靈芝孢子粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要依據(jù)之一，應(yīng)用于質(zhì)量監(jiān)控。

靈芝孢子粉樣品的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示:同一產(chǎn)地不同批次產(chǎn)品間的相似度較高，大于0．97;不同產(chǎn)地產(chǎn)品間的相似度較低，但仍然大于0．8。此特征可用于靈芝孢子粉的產(chǎn)地來(lái)源鑒別。

對(duì)靈芝孢子粉與其他不同部位和不同品種的靈芝類(lèi)樣品中多糖組分的指紋分析及比較的結(jié)果表明，不同部位及不同品種的靈芝類(lèi)產(chǎn)品的指紋圖譜特征呈現(xiàn)較大的差異，這些差異可用于赤芝孢子粉與其他不同部位及不同品種的靈芝產(chǎn)品的鑒別與摻混檢測(cè)。

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