格根塔娜, 薩仁高娃, 于心科, 李鐵剛, 周偉光

(1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2．中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

西菲律賓海比科爾陸架深海沉積物古菌多樣性研究

格根塔娜1, 薩仁高娃2, 于心科2, 李鐵剛2, 周偉光1

(1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2．中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù), 對(duì)西太平洋西菲律賓海東板比科爾陸架5個(gè)不同層位沉積物樣品中的古菌的多樣性進(jìn)行了研究, 并獲得了465個(gè)有效克隆63個(gè)OTUs (Operational Taxonomic Units)。通過(guò)16S rRNA序列與GenBank已知序列的同源性比較及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果顯示, 古菌序列分別來(lái)自泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌(Euryarchaeota), 以Marine Benthic Group B(MBGB)、Marine Group I(MGI)、Miscellaneous Crenarchaeotic Group(MCG)和Marine Benthic Group D(MBGD)為主。少量序列為Marine Hydrothermal Vent Group(MHVG)。研究結(jié)果表明, 該垂直分布的5個(gè)不同層位的沉積物樣品僅有 5個(gè)古菌類群, 古菌群落多樣性并不高, 且 5個(gè)層位中的優(yōu)勢(shì)古菌類群稍有差異。研究結(jié)果揭示了比科爾陸架深海古菌垂向分布特征, 為今后大范圍自然海區(qū)古菌生態(tài)學(xué)研究提供科學(xué)參考。

西太平洋; 沉積物; 古菌; 多樣性

海洋約占地球表面積的70%左右, 而深海沉積物覆蓋了地球表層的50%以上, 由于巨大的廣度和深度, 海底沉積物和上部洋殼是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)之一。海洋生態(tài)環(huán)境獨(dú)特, 具有高鹽、高壓、低溫、營(yíng)養(yǎng)貧乏和光照強(qiáng)度變化大等特點(diǎn)[1], 因此在這種復(fù)雜的獨(dú)特的海洋環(huán)境下生存的大量微生物為適應(yīng)環(huán)境, 在物種類型、代謝類型、功能基因組成和生態(tài)功能上具有多樣性。

深海微生物主要包括古菌和細(xì)菌這兩類原核生物,占了全球生物圈原核生物總數(shù)的 70%[2], 同時(shí)占有1/10～1/3的地球總生物量[3]。其中, 古菌(Archaea)又分為泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌(Euryarchaeota)兩個(gè)界[4], 前者包括極端嗜熱菌、產(chǎn)甲烷菌、嗜鹽菌; 后者有極端嗜熱型古菌、硫酸鹽還原型古菌等。古菌在地球上分布廣泛, 不僅僅只存在于一些高溫、高鹽等極端環(huán)境, 還在包括湖泊、開(kāi)放大洋、熱泉以及沉積物, 溫和的海洋水域中, 極地海洋水域中[5-8], 發(fā)現(xiàn)古菌都廣泛地存在。但 Britschgi[9]在 1991年,Delong[5-6]在1992年、1994年的研究均表明, 古菌的絕大多數(shù)種難以純化培養(yǎng), 即使能培養(yǎng)的也往往是非典型的種屬。傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法由于需要純化培養(yǎng), 就無(wú)法對(duì)古菌進(jìn)行定性分析。目前所報(bào)道分離成功的古菌幾乎都是在極端環(huán)境條件下生存的古菌[10-13]。近幾年來(lái), 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 分子生物學(xué)方法在分類上的應(yīng)用日益廣泛, 特別是 PCR擴(kuò)增和16S rRNA基因序列同源性比較的應(yīng)用。利用分子生物學(xué)方法研究深海微生物, 發(fā)現(xiàn)在深海環(huán)境中微生物的種類數(shù)目要比傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法分離到的種類要廣泛得多。通過(guò) 16S rRNA 基因核酸序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析研究微生物的多樣性和分布情況能夠比較全面地反映環(huán)境中微生物群落的結(jié)構(gòu),已廣泛應(yīng)用于土壤、海洋、湖泊等多種生態(tài)系統(tǒng)中,已取得良好成效[14-15]。因此通過(guò)比較古菌16S rRNA序列的最大相似性, 揭示它們之間及與真核生物之間的進(jìn)化關(guān)系, 為古菌的形態(tài)、生理生化特性、生態(tài)作用的研究奠定基礎(chǔ)。

本文利用 16S rRNA技術(shù)對(duì)西太平洋西菲律賓海比科爾陸架深海沉積物中古菌多樣性作了系統(tǒng)發(fā)育分析, 研究了深海沉積物中古菌的種群結(jié)構(gòu)及其相互間的進(jìn)化關(guān)系, 此項(xiàng)工作的完成為開(kāi)展深海生物圈在物質(zhì)循環(huán)中作用的研究提供了前提。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品的采集

比科爾陸架(Bicol shelf)樣品來(lái)自西太平洋西菲律賓海東板 MD06-3052 巖心(14°48.60′N, 123°29.40′E),水深 703 m。該巖心是由法國(guó)極地研究所 Marion Dufresne號(hào)科學(xué)考察船于2006年6月12日借助中法合作航次 Marco Polo 2, 利用國(guó)際上獨(dú)一無(wú)二的calypso重力活塞取心器采集。工作人員在船上立即對(duì)沉積物進(jìn)行分樣并冷凍于-20℃, 回到實(shí)驗(yàn)室后保存于-80℃。

1.2 主要試劑

土壤 DNA快速提取試劑盒(FastDNA Spin Kit for Soil, QBIOgene, USA)、華舜膠回收試劑盒、pMD-19T Vector (TaKaRa)、Escherichia colibacillusTOP10感受態(tài)細(xì)胞、凝膠成像儀(BIO-RAD)、限制性內(nèi)切酶HhaⅠ和MspⅠ(TaKaRa)、核酸提取儀Fast PrepTM FP120(Thermo Electron Corp, USA)、DYY-6C型電泳儀、TP-600型PCR儀 (TaKaRa)。

1.3 沉積物樣品中總DNA的提取

從西太平洋菲律賓海東板比科爾陸架MD06-3052站位的沉積物柱狀樣選取 5個(gè)不同層位樣品。樣品H, V, Z, J, R分別對(duì)應(yīng)于0.05, 1, 3, 5, 6 m深度的沉積物樣品。沉積物樣品基因組DNA的提取均采用土壤DNA快速提取試劑盒及Fast PrepTM FP120核酸提取儀進(jìn)行提取。各沉積物樣品均取0.4 g泥樣按照試劑盒的操作步驟提取 DNA。提取的基因組 DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將得到的 DNA溶液分裝到多個(gè)離心管中, 短期使用的于4 ℃保存, 長(zhǎng)期儲(chǔ)存的于－80 ℃放置。

1.4 PCR 擴(kuò)增

用提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 古菌16S rRNA基因的擴(kuò)增引物為 Arch 21F (TTCCGGTTGATCCYGCCGGA)和Arch 958R (YCCGCGTTGAM TCCAATT)。PCR 反應(yīng)體系(終體積 12.5 μL)為 10×Taq buffer with KCl 1.25μL, 1.5μmol/L MgCl21μL, 100μmol/L dNTP 1μL, 每個(gè)引物濃度為 1 μmol/L 1μL,BSA 1μL, Taq酶0.2 μL以及梯度濃度的模板。PCR條件為94℃ 變性1 min, 55℃復(fù)性1 min, 72℃ 延伸1 min, 共35個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。選取最適條帶的模板濃度進(jìn)行平行樣擴(kuò)增。

1.5 基因文庫(kù)的構(gòu)建

采用上海華舜生物技術(shù)公司的膠回收試劑盒回收純化沉積物樣品中擴(kuò)增出來(lái)的所有古菌16S rRNA,根據(jù)TaKaRa公司生產(chǎn)的pMD19-T載體手冊(cè)上的方案將回收到的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上, 經(jīng)轉(zhuǎn)化后涂在LB板上培養(yǎng)并初篩出陽(yáng)性克隆。用水煮法快速提取細(xì)胞中的基因組DNA, 通過(guò)菌落PCR對(duì)初篩的克隆進(jìn)行插入片段大小的驗(yàn)證, 所用引物為pMD19-T 載體引物 RV-M (5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和 M13-D (5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′)。PCR 條件為 94 ℃變性 45 s,58 ℃復(fù)性1 min, 72℃延伸1 min 20 s, 共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。

1.6 RFLP分析

將上述片斷大小正確的PCR產(chǎn)物分別用Msp I和Hha I (MBI, USA)兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)于37℃過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠(Akeaibao, Spain)在0.5×TBE緩沖液中進(jìn)行電泳。分析產(chǎn)物酶切后的圖譜, 計(jì)算每種酶切RFLP帶型的出現(xiàn)頻率, 將不同RFLP帶型的克隆子進(jìn)行測(cè)序。

1.7 古菌16S rRNA序列分析

將測(cè)序成功的所有基因序列分別與 NCBI Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中nucleotide blast程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì), 搜索與數(shù)據(jù)庫(kù)中最相似的核苷酸序列。根據(jù)搜索結(jié)果并參照有關(guān)文獻(xiàn)選取參照序列。將古菌16S rRNA序列中, 序列同源性不小于 97%時(shí), 定義為一種 OTUs(Operation Taxonomic Units), 并從NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)的最相似序列用 Clustal X(version 1.8)軟件對(duì)齊,截齊后的序列通過(guò)鄰接法和最大簡(jiǎn)約法, 運(yùn)用DNASTAR和MEGA4程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 并遞交GenBank, 獲取序列登錄號(hào)。本研究所得到的GenBank 序列號(hào)為：GQ994250～GQ994363。

2 結(jié)果

2.1 古菌16S rRNA多樣性指數(shù)及稀釋曲線分析

本文從MD06-3052站位的5個(gè)文庫(kù)得到具有正確插入片段的克隆共465個(gè)(去掉雜合子后), 每個(gè)層位的樣品91～ 96個(gè)克隆不等(表1)。對(duì)具有不同譜型的114個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功的基因序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中nucleotide blast程序進(jìn)行比對(duì), 搜索與數(shù)據(jù)庫(kù)中最相似的核苷酸序列。根據(jù)這些古菌的16S rRNA序列之間的相似性比較, 通過(guò)Dotur軟件在氨基酸 97%相似度水平上歸類后共得到 63個(gè)OTUs。

從表1可看出, 所構(gòu)建的5個(gè)古菌16S rRNA克隆文庫(kù)包含了78.01%～95.60%的古菌多樣性。其中深層(樣品 J)的覆蓋率最高, 達(dá) 95.60%; 上層(樣品 V)的覆蓋率最低, 為78.01%。由所獲得的不同16S rRNA基因型數(shù)目可知, 在整個(gè)柱狀樣中, MD3052V層深海沉積物中微生物的多樣性相對(duì)較高, 深層中相對(duì)較低。小尺度上呈現(xiàn)出隨深度增加而多樣性減少的趨勢(shì)。

表1 深海沉積物古菌16S rRNA克隆文庫(kù)分析Tab. 1 Analyses of 16S rRNA clone libraries of the archaea in deep sea sediments

另外從古菌 16S rRNA基因克隆文庫(kù)的稀釋曲線(圖1)可以看出, MD3052V(1 m)的斜率較高,MD3052J的斜率較低, 趨于平緩, 這一結(jié)果進(jìn)一步證明了該環(huán)境中深層的優(yōu)勢(shì)菌突出, 接近飽和這一結(jié)果。

圖1 古菌16S rRNA基因文庫(kù)稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of 16S rRNA clone libraries of the archaea

2.2 古菌16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

據(jù)表2顯示, 古菌 16S rRNA 基因序列主要來(lái)自泉古菌, 占92.9%。泉古菌又分為4個(gè)類群, 主要為Marine Benthic Group B (MBGB) (58.7%), Miscellaneous Crenarchaeothic Group (MCG) (20%), Marine Group I (MGI) (13.5%)和僅少量的Marine Hyolrothermal Vent Group (MHVG) (0.65%); 且MBGB隨著沉積物的深入而增多的趨勢(shì)。廣古菌則以Marine Benthic Group D (MBGD) (7.1%)為主。

根據(jù)已測(cè)定的古菌 16S rRNA序列之間的同源性比較構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2), 反映古菌彼此間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該沉積物古菌群落的多樣性較低。在 5個(gè)不同層位樣品所構(gòu)建的文庫(kù)中共有 12個(gè) OTUs(代表273個(gè)克隆)屬于 MBGB。無(wú)論是從數(shù)量還是多樣性上看, MBGB均廣泛分布于 MD3052站位深層沉積物的各個(gè)層位。MCG在V(1 m)層中占主要優(yōu)勢(shì), MGI則在表層中占優(yōu)勢(shì)。

MBGB也稱為DSAG (Deep-Sea Archaeal Group),最初發(fā)現(xiàn)于深海沉積物和熱液口[17-18]。事實(shí)上該類群廣泛分布于多種深海環(huán)境, 如大西洋深海沉積物、海底泥火山、黑海碳酸鹽殼、貧有機(jī)物的深海海盆以及大陸邊緣有機(jī)物豐富含甲烷或甲烷水合物的沉積物, 是秘魯邊緣 1230站位甲烷-硫酸鹽轉(zhuǎn)換帶中古菌的優(yōu)勢(shì)類群[3,18-22]。從本文構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中可以看出, 同屬于MBGB的古菌同源性序列主要來(lái)源于 4種環(huán)境, 即太平洋深海、鄂霍次克海、加利福尼亞州圣巴巴拉盆地大陸邊緣沉積物和冷泉環(huán)境。

表2 沉積物古菌16S rRNA基因文庫(kù)克隆系統(tǒng)發(fā)育歸屬關(guān)系Tab. 2 Analyses of the archaeal 16S rRNA gene clone libraries from sediments of the West Pacific Ocean

MCG廣泛存在于多種陸地和海洋環(huán)境, 在海水和沉積物中均有大量分布[17,20,23-25]。本文中其同源性序列來(lái)源于太平洋深海、加利福尼亞州圣巴巴拉盆地大陸邊緣。

MGI發(fā)現(xiàn)于海水中[5], 是海水中古菌的主要類群[4,6-7]。本文中其同源性序列主要來(lái)源于韓國(guó)的海綿共生的古菌, Nankai海槽、地中海、鄂霍次克海、冷泉環(huán)境中的古菌。

MBGD最初發(fā)現(xiàn)于大西洋陸坡和新英格蘭離岸深海平原[18]。本文中其同源性序列來(lái)源環(huán)境同MBGB相同, 主要來(lái)自太平洋深海、鄂霍次克海、加利福尼亞州圣巴巴拉盆地大陸邊緣沉積物和冷泉環(huán)境。

2.3 聚類分析

本文利用 PRIMER 6.0軟件創(chuàng)建 Principal Component Analysis(PCA)聚類圖(圖3)。從圖3可以看出MD3052R和 MD3052J聚在一起, 而它們屬深層位沉積物, 古菌多樣性相對(duì)來(lái)說(shuō)不高, 優(yōu)勢(shì)菌群較為突出。

3 討論

本文以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的構(gòu)建基因文庫(kù)的方法對(duì)西太平洋菲律賓東板比科爾陸架5個(gè)不同層位的沉積物古菌多樣性進(jìn)行了研究。對(duì)沉積物的總DNA直接進(jìn)行分析, 避免了人工培養(yǎng)所造成的偏差, 能夠較好地評(píng)估樣品中的微生物多樣性?；蛭膸?kù)分析方法研究生物多樣性能夠獲得大量目的基因的序列信息, 可以詳細(xì)地揭示樣本中的微生物多樣性直至種的水平。得到的序列信息亦可以作為建立特異性寡核苷酸探針的基礎(chǔ), 為原位雜交等方法提供依據(jù)。盡管他有其缺點(diǎn)(如：樣品總DNA的提取效率偏差; PCR過(guò)程中產(chǎn)生的偏差; 挑取克隆的隨機(jī)性),但到目前, 這種方法廣泛用于深海微生物多樣性研究, 特別是通過(guò)16S rRNA基因文庫(kù)反映微生物群落結(jié)構(gòu)的研究, 這種方法也廣泛用于古菌功能基因多樣性研究。以16S rRNA基因?yàn)檠芯繉?duì)象的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法, 把對(duì)微生物多樣性的研究推進(jìn)到一個(gè)新的時(shí)代。

古菌16S rRNA基因文庫(kù)分析表明, 西太平洋菲律賓東板比科爾陸架泥質(zhì)區(qū)在6 m深度沉積物范圍內(nèi), 古菌多樣性不高, 僅有5種古菌類群。序列來(lái)自兩大類, 泉古菌和廣古菌, 以泉古菌為主。有報(bào)道指出海洋中古菌主要為泉古菌門, 僅有小部分廣古菌門種類[4]。本文做出的結(jié)果符合上述觀點(diǎn)。該區(qū)泉古菌又以MBGB為主。各個(gè)層位中的優(yōu)勢(shì)類群又稍有不同, MCG在V(1 m)層位中較為優(yōu)勢(shì), MGI則在表層 H(0.05 m)中占優(yōu)勢(shì), 隨著沉積物的深入, MBGB占優(yōu)勢(shì)地位, 接近飽和, 其他古菌類群則逐漸減少。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是沉積物中的古菌群落結(jié)構(gòu)受海域和菌群的適應(yīng)性所影響。此區(qū)沉積物古菌的同源序列大部分來(lái)自太平洋深海、鄂霍次克海、加利福尼亞州圣巴巴拉盆地過(guò)渡區(qū)大陸邊緣、地中海、Nankai海槽、韓國(guó)海綿共生的古菌, 冷泉環(huán)境。另外, 古菌群落垂向分布結(jié)構(gòu)總體沒(méi)有顯著差異,只在小尺度上有些不同。

圖2 比科爾陸架深海沉積物中古菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the archaeal 16S rRNA gene sequences recovered from the Bicol shelf mud wedge

圖3 沉積物古菌16S rRNA基因PCA分析Fig. 3 The principal component analysis of 16S rRNA genes obtained from the archaea in deep sea sediments

根據(jù) PCA聚類分析結(jié)果顯示 MD06-3052站位J(5 m)、R(6 m)層位沉積物的古菌16S rRNA基因序列最為相似聚在一起(圖3)。MBGB在這兩層中占的比例也較大, 將近飽和狀態(tài), 是這兩層位中的優(yōu)勢(shì)菌群。另外根據(jù)多樣性指數(shù)及稀釋曲線, 也可詮釋上述結(jié)果。

本文的研究結(jié)果揭示了比科爾陸架深海古菌垂向分布特征, 為今后大范圍自然海區(qū)古菌生態(tài)學(xué)研究提供科學(xué)參考。且西太平洋海域深海沉積物古菌多樣性的研究對(duì)了解深海環(huán)境特點(diǎn)、開(kāi)發(fā)和利用深海微生物資源提供了重要的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

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The diversity of archaea in deep-sea sediments from the West Philippine Sea Bicol shelf

Gegentana1, Sarengaowa2, LI Tie-gang2, ZHOU Wei-guang2, YU Xin-ke1
(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine of Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018,China; 2. Key Laboratory of Marine Geology and Environment, Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Feb., 1, 2010

the West Pacific Ocean; deep-sea sediments; archaea; diversity

The archaeal diversity and phylogenesis of the sediments samples from the Bicol shelf of the West Philippine Sea for the West Pacific Ocean were analyzed by the 16S rRNA gene clone library method. Totally 465 cloning sequences were obtained and divided into 63 OTUs. Phylogenetic analysis showed that the archaeal sequences were from Crenarchaeota and Euryarchaeota. The majority of the archaeal phylotypes were Marine Benthic Group B (MBGB), Marine Group I (MGI), Miscellaneous Crenarchaeotic Group (MCG), and Marine Benthic Group D. A few sequences fell into Marine Hydrothermal Vent Group (MHVG). The results indicated that the sediment samples of five different layers contained only five groups of archaea. Achaeal community diversity was low, and dominant archaea had some differences in each layers.

Q16 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2011)11-0004-07

2010-02-01;

2011-07-21

中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程領(lǐng)域前沿項(xiàng)目(MGE2008KG06);中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KZCX2-YW-JC201,KZCX2-YW-211-03)

格根塔娜(1982-), 女, 蒙古族, 內(nèi)蒙古呼倫貝爾人, 碩士研究生, 海洋地質(zhì)微生物研究, 電話：0532-82898835, E-mail：x.tn2008@163.com; 于心科, 通信作者, 電話：0532-82896726, E-mail：geomicrobiology@126.com

劉珊珊)