樊永軍,閆 偉,王黎元,楊秀麗,鄭月霞

(1.包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014030;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;3.呼和浩特職業(yè)學(xué)院生物化學(xué)工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

極端微生物是生長(zhǎng)在極端自然環(huán)境中微生物的總稱,包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿、嗜壓、抗輻射、極端厭氧等多種類型[1]。極端微生物適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果使其具有獨(dú)特的基因類型,從而也賦予其特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理機(jī)制及特殊的代謝產(chǎn)物,其存在的機(jī)理為更好地認(rèn)知生命現(xiàn)象,發(fā)展生物技術(shù)提供了寶貴的知識(shí)源泉[2]。極端環(huán)境放線菌作為抗生素和酶制劑資源日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3-7]。白云鄂博稀土礦作為中國(guó)最大的鐵-氟-稀土綜合礦床,含有豐富的鐵、螢石和稀土。稀土礦和鈮礦資源居全國(guó)之首,被譽(yù)為“世界稀土之鄉(xiāng)”[8]。但白云鄂博礦床原礦平均含天然放射性釷0.04%,含鈾0.001%,即礦石中的放射性核素釷顯著而鈾較低,釷的含量超過(guò)地殼平均含量近50倍,鈾的含量與巖石土壤相近,可以說(shuō)是一座典型的伴生天然放射性釷礦床[9]。對(duì)該礦區(qū)耐高輻射放線菌的生物學(xué)特征及相關(guān)耐受性進(jìn)行調(diào)查和研究,以期為下一步的深入研究、開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

白云鄂博稀土的東礦區(qū)和主礦區(qū)含釷較高,根據(jù)位置不同,于3月底在東礦區(qū)上、中、下3層分別設(shè)置3個(gè)樣點(diǎn),每個(gè)樣點(diǎn)采3個(gè)土樣分別編號(hào),在采樣點(diǎn)用滅菌鐵鏟除去表面植被和浮土,于地表4 cm以下取樣,將土樣置于滅菌封口袋或土樣盒中帶回實(shí)驗(yàn)室[10]。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與形態(tài)觀察 采用傳統(tǒng)的稀釋平板涂布法對(duì)土壤樣品進(jìn)行分離,37℃培養(yǎng)7～30 d。根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色進(jìn)行初步鑒定并純化,所得純培養(yǎng)物制成凍干牛奶管和斜面保藏于4℃?zhèn)溆?。用淀粉瓊脂培養(yǎng)基(5%NaCl)于37℃條件下進(jìn)行埋片培養(yǎng),培養(yǎng)7、14、21、28 d,分別取出埋片,用光學(xué)顯微鏡Olympus BH-2觀察形態(tài),并記錄拍照。

1.2.2 不同區(qū)域菌落相似性及多樣性分析 ①群落相似性的研究方法[11]:相似性指數(shù)是用來(lái)比較2個(gè)地域或2個(gè)測(cè)點(diǎn)的真菌區(qū)系。在生態(tài)學(xué)中最早Jaccard(1912)提出來(lái)的建立在有-無(wú)的基礎(chǔ)之上,是在2個(gè)地區(qū)都很常見(jiàn)的物種的數(shù)量與在2個(gè)地區(qū)都能發(fā)現(xiàn)的所有物種的數(shù)量的比值。常用公式:

式中c是2個(gè)地區(qū)共同存在的物種數(shù)量,a是僅在a地區(qū)發(fā)現(xiàn)的物種的數(shù)量,b是僅在b地區(qū)發(fā)現(xiàn)的物種的數(shù)量。Sorensen(Jacccard 1948):

它是對(duì)Jaccard改寫,這個(gè)方法適用范圍更廣,可應(yīng)用于定量分析。式中c是2個(gè)樣品共同存在的物種數(shù)量,a和b分別是a地區(qū)(樣品)和b地區(qū)(樣品)中物種的數(shù)量。

②豐富度指數(shù):豐富度指數(shù)(Species richness index)主要是測(cè)定一定空間范圍之內(nèi)的物種數(shù)目以表達(dá)生物的豐富程度,本項(xiàng)研究選用2個(gè)豐富度指數(shù)[12]。

其中S為群落中物種的總數(shù);N為觀察到的個(gè)體數(shù)(隨樣本的增大而增大)。

③放線菌菌落的多樣性分析:物種多樣性是一個(gè)區(qū)域或一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)可測(cè)定的生物學(xué)特征,是生物多樣性在物種水平上的表現(xiàn)形式,因此一般用物種多樣性指標(biāo)來(lái)分析生物多樣性[13]。常用的有物種的豐富度(Richess)、多樣性(Diversity)、均勻度(Evenness)等[14]。選用Shannom-W iener指數(shù)(H)和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D),討論根際土壤的細(xì)菌多樣性特征[15]。多樣性指數(shù)H計(jì)算公式:

均勻度指數(shù)(Evenness index)為群落中不同物種的多度(株數(shù)、生物量、蓋度或其它指標(biāo))分布的程度,即每個(gè)種個(gè)體數(shù)間的差異,也是群落多樣性研究中的一個(gè)十分重要的概念,其計(jì)算常用觀察多樣性和最高多樣性的比來(lái)表示,最高多樣性即所有種的多度相等時(shí)的多樣性[16]。據(jù)此導(dǎo)出了均勻度的計(jì)算公式:

Simpson均勻度

式中,N為所有物種的總個(gè)體數(shù);ni是第i種的個(gè)體數(shù)。

1.2.3 耐受性試驗(yàn) ①鹽類耐受試驗(yàn):放線菌對(duì)鹽類有廣泛的適應(yīng)性,本次實(shí)驗(yàn)中只研究了鈉鹽和鉀鹽對(duì)放線菌的生長(zhǎng)影響[17]。鹽的濃度分別配置成5%、15%、30%的NaCl,設(shè)3個(gè)重復(fù),培養(yǎng)7～15 d,觀察并記錄;②酸、堿耐受試驗(yàn):利用HCl和NaOH分別調(diào)制培養(yǎng)基pH值為1、3、6、9、12,高壓滅菌后接種,培養(yǎng)24、48、72、96 h,觀察菌株的生長(zhǎng)狀況并記錄;③溫度耐受性試驗(yàn)[18]:對(duì)比菌株生長(zhǎng)情況并記錄;④放射元素的耐受試驗(yàn):白云鄂博礦平均含天然放射性釷0.04%,超過(guò)地殼平均含量近50倍,是典型的天然放射性釷伴生礦[9]。為研究菌株對(duì)放射性元素的耐受性,在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入放射源元素釷,根據(jù)釷元素在土壤中的含量,加入高于其1倍的含量,使釷元素的含量達(dá)到0.08%,觀察在含有大量放射性元素的培養(yǎng)基中菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生長(zhǎng)狀況觀察

從白云鄂博礦區(qū)采集來(lái)的土壤中共培養(yǎng)放線菌14株,觀察和記錄了14株放線菌的形態(tài)和特征(表1)。

2.2 不同區(qū)域菌落數(shù)量及所占比例

放線菌的種類百分含量=單菌落數(shù)量/總菌落數(shù)量×100%(表2)。從表2可以看出,放線菌菌落數(shù)量隨著采集位置的降低發(fā)生著明顯的變化,礦頂菌落數(shù)量占57.56%,而礦底所分離純化的菌落數(shù)僅為16.54%,而且在這些菌株中2號(hào)菌株占總菌落數(shù)的24.46%,為優(yōu)勢(shì)菌株。

2.3 不同區(qū)域放線菌生態(tài)學(xué)特征分析

2.3.1 不同區(qū)域菌落相似性分析(表3) 同時(shí)運(yùn)用ISJ和ISS 2個(gè)指數(shù)比較礦區(qū)不同位置土壤中放線菌群落的相似指數(shù),相似指數(shù)越大說(shuō)明2種情況下放線菌菌落的狀況越相近,反之相差越大,礦區(qū)位置不同,使礦區(qū)土壤中放線菌群落狀況發(fā)生了不同的變化。其中東礦頂部和東礦中部的相似性指數(shù)較大,說(shuō)明它們的菌落狀況較相近,而東礦頂部和東礦下部以及東礦中部和東礦下部的相似性指數(shù)較小,說(shuō)明菌落狀況發(fā)生了很大的變化,而且東礦中部和東礦下部的相似性指數(shù)較東礦邊緣和東礦下部大,群落狀況更為相近,而東礦中部和東礦下部的各種環(huán)境因素也較東礦邊緣和東礦下部相近,結(jié)果表明環(huán)境越相似微生物的相似性也越大,反映了環(huán)境對(duì)微生物的影響作用以及微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。

表1 放線菌生長(zhǎng)狀況記錄Table 1 Record on growth status ofActinomycetes population

表2 不同區(qū)域菌落數(shù)量及所占比例Table 2 The quantity and percentage of Actinomycetes population in the different area

表3 不同區(qū)域菌落相似性分析Table 3 The analysis of Actinomycetes population similarity in the different area

2.3.2 不同區(qū)域菌落多樣性分析(表4) 從豐富度上看,隨礦區(qū)位置的降低土壤放線菌群落豐富度指數(shù)降低;從多樣性上看,礦區(qū)位置的降低也使得土壤放線菌群落多樣性指數(shù)降低。說(shuō)明有可能礦區(qū)位置的降低抑制一些放線菌的生長(zhǎng)。表現(xiàn)了環(huán)境對(duì)微生物的脅迫作用以及微生物對(duì)環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果。而均勻度指數(shù)卻隨礦區(qū)位置的降低反而增大,可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采集土樣較少使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不足最終導(dǎo)致計(jì)算均勻度不準(zhǔn)確。

表4 不同區(qū)域菌落多樣性分析Table 4 The analysis of Actinomycetes population diversity in the different area

2.4 放線菌耐性分析

2.4.1 耐鹽性試驗(yàn)(表5) 由表5可見(jiàn),13株放線菌能耐受一定的NaCl濃度,12株放線菌能耐受一定的KCl濃度。大部分放線菌生長(zhǎng)所需的Na+可被K+所替代,如2、7、8、9、11號(hào),能同時(shí)適應(yīng)高濃度(30%)的NaCl和KCl。但也有少數(shù)放線菌例外,如10、12號(hào)能在一定濃度的Na+下生長(zhǎng),在只有KCl的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上卻不能生長(zhǎng),Na+不能被K+所代替,是專性嗜Na+的放線菌;6號(hào)菌株只在一定濃度的KCl條件下生長(zhǎng),卻不能在一定濃度的NaCl條件下生長(zhǎng),這說(shuō)明了放線菌對(duì)不同類型陽(yáng)離子的適應(yīng)也是有一定選擇性的。

表5 不同鹽類濃度環(huán)境下放線菌的生長(zhǎng)狀況Table 5 The growth status ofActinomycetes population under the different salt concentration environment

2.4.2 耐酸、堿性試驗(yàn) 放線菌的酸堿耐受實(shí)驗(yàn)普遍表現(xiàn)為對(duì)堿的耐受性,具體表現(xiàn)為放線菌在pH值為1、3的酸性條件下培養(yǎng)時(shí)1～14號(hào)菌株均無(wú)生長(zhǎng),但在相對(duì)pH值為9的堿性環(huán)境下1～14號(hào)菌株都能夠正常生長(zhǎng),而在pH值為12的高堿性環(huán)境下大部分可以生長(zhǎng),其中2號(hào)菌株正常生長(zhǎng),12號(hào)菌株可較慢生長(zhǎng)。一般情況下,放線菌的最適生長(zhǎng)pH值范圍為5.6～6.0,但在白云鄂博礦區(qū)檢測(cè)到的放線菌最適生長(zhǎng)pH值范圍有所改變,對(duì)pH值的適應(yīng)范圍值增廣且表現(xiàn)為對(duì)堿的適應(yīng)的增廣。這反映了微生物對(duì)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)性以及環(huán)境對(duì)微生物的脅迫作用。

表6 不同pH條件下放線菌的生長(zhǎng)狀況Table 6 The growth status ofActinomycetes population under the different pH values environment

2.4.3 耐低溫或高溫試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果與參考文獻(xiàn)[18]中所得結(jié)果基本相同。

2.4.4 耐高輻射元素試驗(yàn)(表7)

表7 高輻射元素環(huán)境下放線菌的生長(zhǎng)狀況Table 7 The growth status ofActinomycetes population under the different high rational factor environment

試驗(yàn)結(jié)果表明1～14號(hào)菌株在加入礦區(qū)位置2倍含量的釷元素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況,相對(duì)對(duì)照組而言,都有所減弱或完全不生長(zhǎng),這說(shuō)明微生物對(duì)輻射環(huán)境只表現(xiàn)一定的抗性而不是嗜好。

3 討 論

采用稀釋平板培養(yǎng)法從稀土高輻射極端環(huán)境中分離得到14株放線菌,并進(jìn)行了簡(jiǎn)單的菌落形態(tài)特征描述,從這一結(jié)果中可以看出,從稀土高輻射區(qū)域分離得到的可培養(yǎng)的放線菌的種類和數(shù)量要比從一般土壤中得到的放線菌要少的多,目前對(duì)于極端環(huán)境放線菌的分離方法,一般較為常用的仍為稀釋平板法。但是由于其難培養(yǎng)性,極端環(huán)境中放線菌種類的特殊性,導(dǎo)致對(duì)于極端環(huán)境放線菌的分離與利用的瓶頸作用,因此改良分離方法,對(duì)獲取和利用極端環(huán)境放線菌有著非常重要的意義。

應(yīng)用相似性指數(shù)、豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)對(duì)所選14株放線菌進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),白云鄂博東礦區(qū)不同區(qū)域放線菌的生態(tài)分布總的來(lái)說(shuō)隨著開(kāi)礦深度和高輻射元素的分布呈規(guī)律性分布,這也從側(cè)面反映了微生物對(duì)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)性以及環(huán)境對(duì)微生物的脅迫作用。

在耐受性實(shí)驗(yàn)中14株放線菌都有不同程度的耐受性,其中2、7、9、11號(hào)菌株同時(shí)可以在高濃度(30%)的Na+和K+培養(yǎng)基中生長(zhǎng),二者可互相代替,且菌株無(wú)專性嗜好,但6號(hào)菌株只能在K+培養(yǎng)基中緩慢生長(zhǎng),說(shuō)明其不耐高鹽環(huán)境且對(duì)鹽具一定選擇性;通過(guò)耐酸堿性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),白云鄂博礦區(qū)極端環(huán)境中所選放線菌都不耐強(qiáng)酸,但可耐強(qiáng)堿,尤其2號(hào)菌株可在pH為12的環(huán)境中正常生長(zhǎng)。一般情況下,放線菌的最適生長(zhǎng)的pH值范圍為5.6～6.0,但在白云鄂博礦區(qū)檢測(cè)到的放線菌最適生長(zhǎng)pH值范圍有所改變,對(duì)pH值的適應(yīng)范圍值增廣且表現(xiàn)為對(duì)堿的適應(yīng)的增廣。而耐受高輻射元素試驗(yàn)中一些放線菌菌株都有不同程度的生長(zhǎng)減弱,僅有4號(hào)和6號(hào)菌株不能正常生長(zhǎng),這也從一定程度上說(shuō)明所選放線菌對(duì)高輻射元素僅是耐受,并不是完全的嗜好,同時(shí),由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)梯度設(shè)計(jì)偏少,也不能完全說(shuō)明問(wèn)題。本研究中耐低溫或高溫實(shí)驗(yàn),與李琇等得出同樣結(jié)論[19],可見(jiàn)在分離極端環(huán)境中的微生物時(shí),考慮微生物原有的生境,模仿其生境調(diào)整培養(yǎng)基成分及實(shí)驗(yàn)條件有利于微生物的分離。

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