沈和定, 付金花, 冉 福

(上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與利用重點開放實驗室, 上海 201306)

麻痹性貝毒在文蛤體內(nèi)的累積及凈化技術(shù)研究

沈和定, 付金花, 冉 福

(上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與利用重點開放實驗室, 上海 201306)

試驗研究分毒素累積和解毒兩個階段, 文蛤(Meretrix meretrix)對麻痹性貝毒(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)的累積能力試驗中每天投喂一定量塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense), 定期測定文蛤體內(nèi)的毒素含量; 解毒試驗通過投喂餌料和水體消毒的“內(nèi)排外解”法進行。結(jié)果表明： 文蛤?qū)β楸孕载惗镜睦鄯e能力較弱, 累積試驗?zāi)┢?15 d)的內(nèi)臟毒素累積量僅為 884 μg/100g, 內(nèi)臟中毒素累積量高于肌肉,占全貝的77.4%～89.1%。15 d的解毒試驗中, 三組文蛤體內(nèi)的毒素含量都有下降, 對照組毒素排出量占總累積量的30.1%, 臭氧處理組占32.8%, “內(nèi)排外解”法處理組毒素排出比例最高, 達總累積毒素的47.2%。試驗表明,“內(nèi)排外解”法能加快文蛤體內(nèi)PSP的排出。

麻痹性貝毒; 文蛤(Meretrix meretrix); 塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense); 累積; 凈化;內(nèi)排外解

麻痹性貝毒(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)是分布最廣, 危害最大的一類赤潮藻毒素[1-2], 據(jù)統(tǒng)計,每年在全球范圍內(nèi)報道PSP引起的人類中毒事件約2 000起, 死亡率為15%[3], 中國亦已發(fā)生多起疑似PSP引起的中毒事件,主要集中在福建、廣東、香港和臺灣等南方沿海地區(qū)[4]。PSP對海洋生態(tài)平衡、水產(chǎn)資源造成很大危害, 尤其對人類食品安全也構(gòu)成了威脅[5-7]。文蛤號稱“天下第一鮮”, 是中國重要的海洋經(jīng)濟雙殼貝類, 僅江蘇省文蛤養(yǎng)殖面積達3.3萬ha (50萬畝), 年文蛤產(chǎn)量約為6萬t, 占全國文蛤總產(chǎn)量的 50%以上, 且每年向日本出口活鮮文蛤約 1.6萬 t, 占日本進口量的 40%[8]。因此, 研究PSP毒素在文蛤體內(nèi)的累積和排出規(guī)律是一個關(guān)系到消費者食品安全衛(wèi)生和貝類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展亟待進行的課題。本文通過室內(nèi)試驗測定文蛤?qū)?PSP的累積能力和“內(nèi)排外解”法對 PSP的凈化效果, 以期為深入研究赤潮毒素預(yù)防發(fā)生規(guī)律及貝類生物毒素凈化技術(shù)提供理論依據(jù), 對貝類食品安全體系建設(shè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

文蛤(Meretrix meretrix)購于上海市圖們路農(nóng)貿(mào)市場(原產(chǎn)地江蘇連云港)。所買文蛤健康, 無損傷,平均殼長3.5 cm。

塔瑪亞歷山大藻 ATHK藻株由中國科學(xué)院海洋研究所提供, 培養(yǎng)條件為非無菌培養(yǎng), f/2培養(yǎng)基。海洋小球藻(Chlorella marine)和等邊金藻(Isochrysis galbana)由上海海洋大學(xué)海洋生物研究室提供。各單胞藻均以f/2-Si營養(yǎng)液進行培養(yǎng), 塔瑪亞歷山大藻培養(yǎng)溫度20 ℃, 光照3 000 lx, 光暗比 12 h ： 12 h。培養(yǎng)藻類海水均以 0.22 μm孔徑濾膜過濾并高溫殺菌。試驗用海水均由濃縮海水調(diào)配而成, 海水鹽度30。

BIO-Ⅲ(Ⅲ X808 Ⅲ)型酶標儀, LAB 400R高速冷凍離心機,均質(zhì)器,臭氧發(fā)生器(SW250), TUNZE O3/mV-Controller-set 7075氧化還原電位測定儀。

RIDASCREEN PSP試劑盒由德國r-biopharm公司生產(chǎn), 試劑盒包含PSP標準溶液、PSP酶標記物、基質(zhì)、發(fā)色劑、反應(yīng)停止液、緩沖液及包被有特異抗體的微孔板條。

0.1 mol/L和 0.5 mol/L的 HCl。

1.2 儀器和試劑

1.3 試驗方法

1.3.1 累積試驗

購買的文蛤經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾的海水中暫養(yǎng)7 d, 暫養(yǎng)期間以海洋小球藻投喂, 集中養(yǎng)殖在 1000 mL的大燒杯內(nèi)備用。試驗開始前停食1 d。試驗時隨機選取5個文蛤放入盛有海水的250 mL燒杯中,電熱棒水浴控制試驗溫度 22℃。每只文蛤每天投喂塔瑪亞歷山大藻, 藻細胞密度為 2.0×103個/mL(藻細胞毒性水平 11 pg/個[9], 以 STXeq含量計)。白天每1～2 h檢測一次藻細胞濃度并及時補充藻液。每天全換水一次, 每天晚上 8：00投喂小球藻以維持貝的體能。隔天取出5只文蛤作為一個樣品, 解剖、將文蛤內(nèi)臟和肌肉分開、去離子水沖洗2次, 瀝干后分別袋裝封存于-18℃冰箱中留待檢測毒素含量。文蛤?qū)SP的累積率由如下公式進行計算：

R為每g組織中PSP的累積率, 單位： %;P為組織中 PSP的毒素含量, 單位： μg /100g(以 STXeq含量計);P0為藻細胞毒性水平, 單位： μg /個(以 STXeq 含量計);N為投喂藻細胞數(shù)量, 單位： 個;A為同化率,水溫22℃下藻細胞密度為 2.0 ×103個/mL時文蛤?qū)λ攣啔v山大藻的同化率為67.9%[10]。

1.3.2 解毒試驗

染毒15 d后的貝樣, 解剖后以去離子水沖洗兩次, 瀝干后封存于-18℃的冰箱中, 及時檢測毒素含量, 即為解毒試驗前文蛤體內(nèi)的毒素含量。然后對已染毒的文蛤進行解毒處理, 設(shè)對照組、臭氧處理組(A組)和“內(nèi)排外解”法處理組(B組), 各組處理方法如表1。從解毒的第3天開始取樣, 以后隔2 d取樣一次, 取樣方法同毒素累積試驗。試驗持續(xù)15 d。

1.3.3 樣品處理方法

將貝肉樣品用均質(zhì)器均質(zhì), 稱取10 g均質(zhì)后的樣品加入10 mL0.1mol/L的HCl, 煮沸并攪拌5 min。4℃下, 13 000 r/min離心10 min, 離心后用5 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH到4.0以下。取100 μL上清液, 用樣品稀釋緩沖液按適當比例稀釋, 然后保存于 4 ℃下,留待檢測。

1.3.4 毒素檢測計算方法

PSP檢測均按德國拜發(fā)公司生產(chǎn)的 PSP毒素檢測試劑盒的使用說明操作(產(chǎn)品編號： R1902), 所得的 PSP標準液百分比吸光度值與 PSP質(zhì)量濃度(μg/kg)的校正曲線如圖 1; 以德國拜發(fā)公司自制軟件r-biopharm softwin進行毒素含量計算。

表1 解毒階段處理方法Tab. 1 Design for detoxification

圖1 PSP標準液百分比吸光度值與PSP質(zhì)量濃度的校正曲線Fig. 1 Calibration curve of RIDASCREEN FAST PSP test

2 試驗結(jié)果

2.1 文蛤體內(nèi)毒素累積規(guī)律

圖2反映了文蛤肌肉和內(nèi)臟組織PSP累積量的差異。每天投喂毒藻細胞 3×106個時, 文蛤的肌肉組織在第3次取樣時, 即暴露于毒藻中5 d后, 其肌肉中累積的毒素達到 93.8 μg/100g, 其后緩慢升高,在累積階段末期最高也僅僅達到 122.4 μg/100g。而文蛤內(nèi)臟的毒素累積量則明顯高于肌肉, 文蛤僅在毒藻中暴露 1 d, 其內(nèi)臟中的毒素量就達到 117.0 μg/100g, 超過了貝類食用安全標準, 之后, 文蛤毒素含量急劇上升, 在累積階段末期內(nèi)臟毒素含量達到 884.0 μg/100g, 占貝體毒素累積總量的 77.4%～89.1%。

圖2 累積階段文蛤內(nèi)臟與肌肉中毒素水平的比例Fig. 2 The ratios of PSP in clam viscera and muscles during accumulation

從表2可以看出文蛤?qū)SP的累積率隨時間延長呈下降趨勢, 第 1天其內(nèi)臟和肌肉中的毒素累積率分別達到 12.04%和 3.37%, 之后其累積率迅速下降, 特別是內(nèi)臟中毒素的累積率。內(nèi)臟中毒素的累積率為 4.36%～12.04%, 明顯高于肌肉中毒素的累積率0.74%～3.37%。

2.2 文蛤體內(nèi)毒素排出規(guī)律

如圖3所示, 解毒試驗中3組文蛤全貝的毒素含量均不斷下降, 文蛤體內(nèi)毒素起始含量為 324.0 μg/100g, 毒素排出速率先快后慢, 特別是前 3天毒素排出速率相對較快, 其中對照組排出總毒素的16.3%, 平均每天排出總累積毒素的 5.43%; A組為31.0%, 平均每天排出10.33%; B組為40.2%, 平均每天排出 13.40%。之后各組排毒速率都平穩(wěn)降低, 至解毒階段末期, 對照組排出總毒素的30.1%, 平均每天排出總累積毒素的2.01%, A組為32.8%, 平均每天排出 2.19%, B組排毒量最高為總累積毒素的47.2%, 平均每天排出總累積毒素的3.15%。

表2 累積階段文蛤毒素累積狀況Tab. 2 Comparison of PSP in clam viscera and muscles during accumulation

圖3 排毒階段PSP在文蛤體內(nèi)的含量變化Fig. 3 PSP concentrations in detoxification

3 分析與討論

本試驗主要研究了麻痹性貝毒在文蛤體內(nèi)的累積規(guī)律及排出方法, 因貝類的濾食是在黏液纖毛作用和水動力學(xué)作用兩種互補機制下進行[11-12], 在一定條件下, 例如餌料濃度過高或者餌料不適口等,藻細胞進入鰓后不進入消化道而是通過簡單的黏液包裹后立即從外套膜排出體外, 也就是貝類的假糞,而假糞的出現(xiàn)無疑會對試驗觀察的真實性和測量結(jié)果的準確性造成很大的干擾, 預(yù)試驗期間摸索不產(chǎn)生假糞的藻類濃度, 試驗中嚴格控制假糞的產(chǎn)生。同時, 同化率作為文蛤?qū)?PSP累積率的一個重要因素,受多種因子的影響, 如水溫、鹽度等[10], 因此本試驗的溫度和鹽度皆為文蛤的最佳攝食溫度和鹽度, 且冉福等[10]在研究塔瑪亞歷山大藻對文蛤的同化率時發(fā)現(xiàn), 在藻細胞密度為 2.0×103個/mL以內(nèi)時文蛤具有較高同化率, 因此在本試驗中, 為保證試驗結(jié)果的真實可靠性, 控制塔瑪亞歷山大藻的密度為2.0×103個/mL。

3.1 毒素在文蛤體內(nèi)的累積能力分析

文蛤在毒素累積1d時內(nèi)臟累積毒素達117.0 μg/100g, 說明其不需要1d時間就達到食用貝類毒素安全標準為80 μg/100g, 即每天給文蛤投喂毒藻3×106個時, 不到一天即超過 PSP的預(yù)警值, 此種文蛤已不適用于食用。與其他貝類相比文蛤的毒素累積能力并不很強。朱明遠等[13]也曾對櫛孔扇貝(Chlamys farrei)進行了 PSP累積研究, 結(jié)果證明櫛孔扇貝在48 h內(nèi)內(nèi)臟累積毒素達5 000 μg/100g, 說明其在數(shù)小時內(nèi)即達食用貝類毒素安全標準。Bricelj等[14]得出結(jié)論無論是高毒還是低毒的亞歷山大藻(細胞毒性分別為 96.5和 5.9 pgSTXeq.)均可使硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)在5～7 h內(nèi)達到該標準, 同時在紫貽貝體內(nèi) PSP累積規(guī)律的研究中也選擇了高毒性的藻株Alexandrium fundyense, 并將貝暴露于高濃度的藻細胞中12～13 d后, 紫貽貝的毒素含量即達到最高。而本試驗所采用的藻株毒性相對不高, 且由于本試驗到染毒1 d時才測其毒性, 無法同其比較,但從結(jié)果亦可推斷文蛤的毒素累積能力并不強于其他蛤。試驗中 PSP在文蛤內(nèi)臟中累積的毒素含量高于肌肉中毒素的含量, 且 PSP在文蛤肌肉中毒素含量變化相對于毒素在內(nèi)臟中毒素的含量變化較為平緩, 同時文蛤在內(nèi)臟中毒素的累積量遠遠沒有達到飽和, 這與貝類的毒素累積能力、藻毒性、藻濃度和累積時間有密切關(guān)系, 所以文蛤內(nèi)臟中 PSP累積能力有多大, 需要進一步研究。

3.2 毒素在雙殼貝類體內(nèi)排出規(guī)律比較

Bricelj等[15]根據(jù)以往研究總結(jié)了貝類對PSP的敏感性及毒素累積能力, 認為其差異主要體現(xiàn)于 3個方面： 對 STX 的神經(jīng)抵抗性; 攝食及其他行為反應(yīng); 累積能夠達到的最大毒素含量, 并根據(jù)毒素的排出速率, 將雙殼貝類分為三大類： 快、中和慢速排毒者。多數(shù)貽貝和牡蠣屬于前者, 大多數(shù)蛤與扇貝則屬于后者。本試驗解毒階段, 對照組排出總累積毒素的 30.1%, 平均每天排出總累積毒素的 2.01%, 與其他貝類相比, 其毒素排出率相對較小[16-17]。根據(jù)Bricelj和Shumway按照毒素排出速率對雙殼貝類的劃分, 本試驗所用文蛤應(yīng)歸于慢速排毒者。而貝類的去毒過程又分為兩個階段： 前期的快速階段和后期的慢速階段。其中快速階段是通過內(nèi)臟排出未吸收的毒素; 慢速階段中則大多排出內(nèi)臟和其他組織中吸收的毒素[18-20]。本試驗中解毒過程很明顯分為兩個階段, 前三天排毒速率較快, 為前期的快速排毒階段, 后 12天排毒速率較慢, 為后期的慢速排毒階段, 這與雙階段排毒理論基本相符, 但兩個階段的長度差異較大。

3.3 “內(nèi)排外解”法對毒素的排出效果評價

麻痹性貝毒是貝類毒素中毒性最強危害也最大的一種, 因此貝類毒素的排出主要是針對麻痹性貝類毒素。貝類一旦染上毒素, 其組織將毒素排出需要很長的一段時間, 有些貝類甚至需要 3年以上才能完全排出毒素。貝類排毒素的速率因種群和季節(jié)的不同而存在明顯差異[21]。本試驗通過“內(nèi)排外解”法凈化文蛤體內(nèi)的 PSP毒素, 即通過投喂高濃度的無毒單胞藻促進貝類體內(nèi)毒素的新陳代謝, 保證了機體在排毒過程中的供能, 從而加快了毒素的排出速率, 同時用臭氧消毒法定期對水體進行凈化消毒處理, 分解破壞水中的 PSP, 以提高貝類的凈化效率。從解毒試驗全程看, 對照組與臭氧處理組(A組)最終結(jié)果相差不大, 而“內(nèi)排外解”法處理組(B組)最終排出總累積毒素的47.2%, 高于對照組30.1%。解毒前三天的試驗結(jié)果說明O3對快速排毒階段有較大的貢獻, 其可能是因為臭氧凈化了海水中的毒素,且解毒前期文蛤體內(nèi)儲存了較多的能量, 因此排毒速率較快。但隨著排毒的進行, 文蛤排毒的速率有所降低, 雖然對照組排出大量毒素, 但其前期排毒量甚少, 而A、B組的排毒量在前期排出較多毒素的情況下, 后期又排出大量毒素, 且 B組大于 A組的排毒量, 因此給文蛤投喂等邊金藻在一定程度上能提高后期慢速排毒階段的排毒量。

麻痹性貝毒排出的最好方法是將貝類轉(zhuǎn)移到清潔水體中使其自凈, 但其效果好壞與貝類的種類有關(guān), 有些貝類在清潔水體中相當長時間后仍有較高的毒素含量, 還有一些貝類在轉(zhuǎn)移后毒素含量反而上升, 同時轉(zhuǎn)移大量貝類也是一件極為費時費力的工作[22]。本試驗所采用的“內(nèi)排外解”法, 即通過給文蛤投喂單胞藻即“內(nèi)排”和O3處理海水“外解”方式對染毒文蛤排毒有一定的作用, 特別是能提高快速排毒階段的排毒效率, 加快了文蛤體內(nèi) PSP的排出進程。其他一些物理的、化學(xué)的關(guān)于 PSP的排出方法也有過研究。東南亞聯(lián)盟包括馬來西亞、新加坡、泰國、菲律賓和印尼, 其貝類凈化系統(tǒng)主要采用紫外線系統(tǒng)。西班牙作為歐盟中消費貝類最多的國家, 主要采用含氯消毒劑消毒法。法國用臭氧法作為凈化貝類的主要手段, 但到目前為止還沒有一種有效的大規(guī)模的人工排出貝類毒素的方法。烹飪法亦被認為是 PSP排出的好方法之一, 也是最后一道防線。煮、蒸、炸可在短時間內(nèi)使毒素在高溫下因貝類失水而滲出。目前值得推薦的烹飪法是油炸法, 因其溫度更高、排毒更有效、并能避免更多的毒素流入湯中的優(yōu)點。烹飪法可以降低毒素含量, 但因其只有貝毒含量較低時, 烹飪法才可能將毒素降到安全標準[23], 所以其并不能消除人類貝毒中毒的危險性。同時研究表明商業(yè)性罐頭加工也是一種降低 PSP的好方法之一, 這種工藝流程包括在絕緣套中先充入蒸氣預(yù)蒸 15～20 min, 然后將蛤肉分離, 去除吸管,將剩余蛤肉用溫水清洗, 再壓入罐頭。預(yù)蒸時滲出的肉湯毒素含量一般較高, 但往往只是其中的一小部分被壓入罐頭, 大部分已被去除, 因此這種加工工藝對降低毒素含量很有效果, 但其有效性也取決于初始毒素的水平, 因此使用時應(yīng)謹慎對待[24]。這些方法均存在著不完善的地方, 有的不安全, 有的太慢,有的經(jīng)濟可行性差, 有的其終產(chǎn)品無論從外觀上還是從味道上都無法被接受。但全球有毒赤潮的發(fā)生呈上升趨勢, 發(fā)展有效地快速排毒方法, 加強海產(chǎn)品管理, 減少 PSP對人類的危害是極其必要的。采用“內(nèi)排外解”法凈化文蛤體內(nèi)的PSP毒素試驗中,由于凈化用文蛤體內(nèi)的 PSP初始濃度比較高, 達貝類食用安全標準的 4倍多, 在一定程度上提高了貝毒凈化的難度。染毒文蛤經(jīng)15 d的凈化, 體內(nèi)PSP含量雖沒有降至貝類食用安全標準以內(nèi), 但試驗結(jié)果仍能為貝毒的凈化技術(shù)研究提供新的理論依據(jù)和實際參考。

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Accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison(PSP) in hard clamMeretrix meretrix

SHEN He-ding, FU Jin-hua, RAN Fu
(The Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization Ministry of Agriculture, Shanghai Fisheries University, Shanghai 201306, China)

Feb., 18, 2010

Paralytic Shellfish Poisoning(PSP);Meretrix meretrix;Alexandrium tamarense; accumulation; detoxification; “Inner discharge and out purification”

There were two stages in the experiment, accumulation and detoxification. Accumulation PSP by hard clamMeretrix meretrixachieved by feeding clams certain amount paralytic shellfish poison (PSP) every day and detecting PSP periodically. The detoxification was determined by method of “inner discharge and out purification”.We found that the clam had a low ability to accumulate PSP. It reached to 884 μg /100g after exposed to toxicA.tamarensefor 15 d and the toxins in the viscera were higher than in other muscles, accounting to 77.4%～89.1%.The amounts of PSP decreased in three groups with the elimination rates of the control group 30.1%, ozone purified group 32.8%, group of inner discharge and out purification 47.2% during detoxification. This research showed that“inner discharge and out purification” could accelerate PSP detoxification.

Q939

A

1000-3096(2011)07-0045-06

2010-02-18;

2010-04-11

上海市教委發(fā)展基金項目(科03-125); 上海市教委重點學(xué)科建設(shè)項目(J50701)

沈和定(1964-), 男, 浙江奉化人, 教授, 主要從事貝類增養(yǎng)殖和貝類食品質(zhì)量體系建設(shè)研究, 電話： 021-61900446, E-mail：hdshen@shou.edu.cn

致謝：塔瑪亞歷山大藻 ATHK藻株由中國科學(xué)院海洋研究所鄒景忠研究員惠贈, 謹致謝忱！

張培新)