張 柯,丁翠玲,張 棟

(山東大學 威海分校 海洋學院,山東 威海 264209)

貝類屬于軟體動物門,全世界貝類現(xiàn)存1.1萬種左右,其中 80%生活于海洋中,它是自然界生物中僅次于昆蟲類的第二大族類。貝類中絕大多數(shù)種類均可食用,很多貝類的肉質肥嫩,鮮美可口,營養(yǎng)豐富。海洋貝類已發(fā)展為海水養(yǎng)殖的重要對象,產(chǎn)量也極為可觀。不少貝類是不可缺少的優(yōu)良中藥材,如珍珠和珍珠層粉、鮑的貝殼石決明、寶貝的貝殼海巴、烏賊的內(nèi)殼海鰾蛸、海兔的卵群等。與陸生生物的次生代謝產(chǎn)物相比,海洋生物由于生活環(huán)境復雜門類多樣化,其天然產(chǎn)物具有很多新型的結構骨架和獨特的化學結構,也具有更強烈的生物活性。隨著研究的逐步深入,不少學者發(fā)現(xiàn)相當一部分海洋動植物中的活性物質來源于其附生微生物。由于海洋微生物具有可產(chǎn)生種類多樣、結構新穎的活性物質及易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的特點,所以海洋微生物作為活性物質的可持續(xù)性資源正日益受到國內(nèi)外學者的重視[1-2]。

我國是世界貝類養(yǎng)殖大國,形成規(guī)模養(yǎng)殖的經(jīng)濟貝類有近20種,貝類養(yǎng)殖已經(jīng)成為威海市海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一。但是隨著我國沿海城市工業(yè)的迅速發(fā)展,向海洋排放的廢棄物日益增多,部分水域已受到不同程度的污染。貝類的生長位置比較穩(wěn)定,一旦遇到水質污染,較易受到污染。再者雙殼貝類屬于濾食性生物,在濾食餌料生物的同時,也將水中的有害物質吸入體內(nèi)。食用不潔貝類極易引發(fā)疾病,從而局部暴發(fā)食品中毒事件。我國政府近年來對食品安全十分重視,并積極采取多種措施,加強對貝類的衛(wèi)生管理,確保貝類的食用安全。為了解海洋貝類產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況以及消費者食用貝類產(chǎn)品受微生物污染的危害程度,作者就威海近海主要海洋貝類進行附生微生物區(qū)系分析,對其食用安全性做出正確的評價,不僅可以為有效保證貝類食用安全提供理論依據(jù),還可增強貝類貿(mào)易市場競爭力,對完善和提高我國貝類安全管理水平,保證國民身體健康和在國際貿(mào)易中維護自身利益均有重大意義[3-4]。

本實驗從山東威海近海海域多處地點采集 6種具有代表性海洋貝類,對其附生細菌進行多樣性分析,以實驗室保藏鰻弧菌 W1為指示菌篩選出其中具有較強抗菌活性的菌株,為進一步開展海洋微生物抗菌活性物質的研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

實驗所需樣品貝類均于2010年4～6月采自山東威海近海海域、小石島養(yǎng)殖場和不同的貝類人工養(yǎng)殖場等多個不同地點。采集時用塑料袋裝取適量海水運輸以保持其鮮活。在采樣2 h內(nèi)將樣品處理[5]。

1.2 培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g,酵母粉1 g,檸檬酸鐵0.1 g,陳海水1 000 mL,pH 7.6。

TCBS培養(yǎng)基：TCBS合成培養(yǎng)基加水溶解[6]。

1.3 附生細菌的分離

首先用無菌海水反復沖洗樣品,用鑷子無菌操作取出貝肉,用無菌海水反復沖洗。稱取3～5g樣品放入研磨器內(nèi),加3 mL無菌海水充分研磨。將研磨液用無菌海水稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五個濃度。用涂布棒均勻涂布于2216E培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)96 h。挑取不同菌落于2216E平板上劃線分離,以獲得純培養(yǎng)。將分離的不同菌株接種于 TCBS培養(yǎng)基上,觀察菌株是否能夠生長及其菌落形態(tài)。利用-80℃冰箱保藏菌種[7]。

1.4 抗菌活性篩選

以實驗室保藏菌種 W1為實驗用敏感指示菌,用平板點種法篩選具有抑菌活性菌株。以 DH5α作為陰性對照,以實驗室保藏 A18為陽性對照。培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)抑菌圈大小判斷抑菌活性。

1.5 16S rDNA序列測定和分析

1.5.1 PRC模板DNA的制備

將細菌接種于2216E平板上,28℃培養(yǎng)過夜。取單一菌落懸浮于20μL無菌蒸餾水中。于100℃水浴加熱10 min,立即放入冰水混合物中。

1.5.2 16S rDNA基因序列的PCR擴增與測序

擴增16S rDNA的正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′,反向引物1492R：5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′在 50 μL的PCR反應體系中含有：1×PCR緩沖液,1.5 mmol/L MgC12,4×dNTP混合物各 200 μmol/L,引物各 0.5μmol/L,Taq DNA 聚合酶 0.8 μL(5U/μL),1 μLDNA原液。PCR反應條件為：94℃預變性6min; 接94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,35個循環(huán);最后72℃溫育8 min,4℃保存[7]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,直接交由北京三博遠志生物有限責任公司進行序列測定。

1.5.3 序列分析及數(shù)據(jù)處理

將測定的基因序列輸入GenBank,獲得收錄號。并運用 Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已存在的細菌 16S rDNA序列進行相似性比較分析。利用MEGA4.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,確定其系統(tǒng)發(fā)生學地位。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

根據(jù)菌落在2216E培養(yǎng)基及TCBS培養(yǎng)基上的形態(tài)、大小、顏色等表觀特征,選取不同類型的有代表性的菌落,從采集自威海近海的 6種代表性貝類中共分離得到100株海洋細菌。挑取這些海洋細菌,平板劃線純化至單菌落。利用-80℃冰箱保藏菌種。

2.2 16S rDNA序列測定

從分離到的100株細菌中選出43株有代表性的純培養(yǎng)細菌進行16S rDNA擴增和測序,將測得的序列提交到 GenBank,獲得收錄號(HQ443218、HQ538732-HQ538773),利用 Blaster進行相似性比較[8]。利用 MEGA4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)生學分析,結果見圖1。

結果顯示,測序的45株細菌分別屬于21個屬,Psychrobacter屬分布最多有 7株,5株分布在Pseudoalteromonas屬,Arthrobacter,Vibrio兩個屬分別有4株。其中ZH18與Micrococcus luteus具有最高同源性,但兩者有明顯的區(qū)別,可能為潛在的新種。杜宗軍等[9]從?？蟹蛛x到的56株細菌分屬于Pseudoalteromonas,Colwellia,Vibrio,Acinetobacter,Pseudomonas,Endozoicomonas,Roseovarius,Paracoccus,Loktanella,Leisingera,Sulfitobacter,Bacillus,Staphylococcus,Plantibacter,Microbacterium,Micrococcus,Joostella,Psychroserpens,Cellulophaga,Krokinobacter,Polaribacter和Psychrobacter共22個屬。分布于Pseudoalteromonas屬的菌株最多,達到了16株,4株屬于Vibrio屬,有7株與已發(fā)現(xiàn)細菌的最高相似度在97%以下,可以認為是潛在的新種。在分離到的56株細菌中17株可產(chǎn)蛋白酶,20株產(chǎn)脂肪酶,NQ8對指示菌具有很強的拮抗作用。通過兩個實驗的結果對比可分析出,海洋動物附生細菌多分布在Pseudoalteromonas屬,Vibrio屬也有較多分布,其中一些菌株對弧菌屬有較強拮抗作用。目前,可根據(jù)海洋動物體內(nèi)弧菌屬細菌的分布情況對其食用安全性做出正確的評價。一些病原性弧菌?？稍谏蓉惖挠缙诖罅糠敝?引起貝類幼苗的疾病,短時間內(nèi)可使貝苗大量下沉、死亡,造成極大的經(jīng)濟損失。通過本次的實驗結果可以分析出,自然海域及人工養(yǎng)殖場的海洋貝類附生細菌中不同程度的都存在對人類健康產(chǎn)生威脅的致病菌,人們在食用海洋貝類時,應充分加工殺滅其中的病原性微生物以保證食用的安全性。

圖1 威海近海海洋貝類附生細菌及其他相關細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbour-joining tree of bacteria attached on the marine shellfish isolated from Weihai coast and some related strains

圖2 SA10對Vibrio gallicus V8產(chǎn)生的抑菌圈(圖中4所示)Fig.2 Inhibition zones produced by SA10 (marked as 4) to Vibrio gallicus V8

2.3 弧菌拮抗菌的篩選

采用平板點種法,以實驗室保藏弧菌 W1 (Vibrio anguillarum)、V8(Vibrio gallicus)為實驗指示菌,對從海洋貝類中分離到的 100株細菌進行抗菌活性篩選。抑菌實驗篩選出 2株具有較高抗菌活性菌株SA10及 ZH18。兩株具高抗菌活性的菌株分別屬于Pseudoalteromonas和Micrococcus兩個屬。

3 討論

從威海近海 6種海洋貝類中篩選分離出 100株附生細菌,根據(jù)菌株的顏色、表面狀態(tài)、邊緣形狀、是否透明等表觀特征從中選出 43株進行了 16S rDNA序列測定和分析。其中 36株細菌可鑒定到種[7]。這43株細菌分布在21個屬中,其中有7株分布在Psychrobacter屬,5株分布在Pseudoalteromonas屬,Arthrobacter,Vibrio兩個屬分別有4株。

從以上結果可以看出,威海近海貝類附生細菌具有較大的多樣性。各份樣品中均檢出了一定數(shù)量的致病菌,隨著在食物鏈中的傳遞與積累,必將由此引起人類的健康問題,這提醒我們要高度重視海洋貝類的食用安全。我們應對養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生安全引起足夠重視,在食用海洋貝類時應充分加熱以達到食用安全,海洋貝類的食品安全問題是一個需要我們長期關注的重要課題。

貝類因其棲息環(huán)境、攝食方式等限制,成為微生物的良好宿主。海洋貝類中的附生微生物與宿主之間有著緊密的聯(lián)系。某些附生微生物可以產(chǎn)生抗生素以利于一些防御能力較差的宿主在復雜的海洋環(huán)境中生存。其中有很多結構新穎的活性物質是潛在的新藥來源。

我國海域面積廣闊,海洋貝類更是分布廣泛、種類繁多。海洋貝類體內(nèi)多樣的微生物是開發(fā)海洋貝類活性物質及海洋藥物潛在的寶貴資源。海洋貝類附生細菌多樣性分析是對其開發(fā)利用的基礎,但其中大多數(shù)還處于非培養(yǎng)狀態(tài),相信隨著現(xiàn)代微生物技術的迅猛發(fā)展,可培養(yǎng)的細菌種類會越來越多,新類別細菌的發(fā)現(xiàn)有利于人們對于海洋微生物的開發(fā)工作,相關的進一步研究有待更多學者的不斷研究。

致謝：本研究承蒙我的指導老師杜宗軍副教授及苗婷婷女士指導完成,感謝他們的熱心指導和大力幫助,謹致謝忱。

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