楊賢子 程甜甜 駱志國 蔣 飛 柴海霞

白介素18(IL-18)具有強(qiáng)烈誘導(dǎo)IFN-γ的能力，能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。無活性的IL-18前體(24 kD)需要經(jīng)過IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE，caspase-1)的剪切才能形成有活性的成熟IL-18(18 kD)[1]。IL-18前體還可以通過粒細(xì)胞蛋白水解酶(PR-3，proteinase-3)的酶切產(chǎn)生活性。但I(xiàn)L-18前體若被caspase-3剪切則失去生物學(xué)活性[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-18通過巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生其他抗腫瘤因子，加強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫力，在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中備受關(guān)注，在臨床應(yīng)用中有重要價值。本研究旨在觀察IL-18及其相關(guān)的正負(fù)調(diào)節(jié)基因在正常人類肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中表達(dá)情況，從而進(jìn)一步闡述IL-18在人類肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，為原發(fā)性肝癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

正常人類肝細(xì)胞株QSG-7701(來源于一位女性肝癌患者的癌旁組織)，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。人類原發(fā)性肝癌細(xì)胞株MHCC97-L和HCCLM3，由武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤防治研究中心免費(fèi)提供。這3種人類細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(杭州四季青生物公司)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中(GIBCO公司)，培養(yǎng)條件為37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2。

1.2 RT-PCR檢測細(xì)胞株中IL-18及其正負(fù)調(diào)節(jié)基因mRNA的表達(dá)

應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參照基因GAPDH的PCR反應(yīng)引物。引物序列和PCR反應(yīng)條件(表1)，均由上海生工生物工程公司合成。QSG-7701、MHCC97-L和HCCLM3細(xì)胞株，均以每瓶2×106個細(xì)胞接種于標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，按照Trizol試劑(MRCGENE公司)說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度和濃度后，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis成套試劑盒(MBI Fermentas公司)操作合成cDNA。為了確保RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性，所有的cDNA都先要與特異性的寡核苷酸引物(1種構(gòu)成性表達(dá)的基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶，GAPDH)一起進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)液的終體積為50 μl，含cDNA 2 μl、10 pmol/μl寡核苷酸引物各1 μl、10×PCR緩沖液(含Mg2+) 5 μl、dNTP混合液4 μl、DEPC處理水36.75 μl和5 U/μl Taq DNA聚合酶 0.25 μl (TaKaRa公司)。PCR擴(kuò)增后，取10 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物在EB染色的2%瓊脂糖凝膠中電泳。應(yīng)用凝膠成像掃描分析系統(tǒng)(MultilmageTM Light Cabinet，美國Alpha Innotech公司)測定所有條帶，應(yīng)用AlphaEaseTMv5.5軟件，分析所有條帶各自峰面積值，定義為該條帶的吸光度值(OD)，而目的基因mRNA的相對表達(dá)量，則用目的基因(T)與內(nèi)參照基因(C)吸光度值的比率(T/C OD Ratio)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列表

F為正向引物；R為反向引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α=0.05。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。

2 結(jié)果

人類肝癌細(xì)胞株MHCC97-L和HCCLM3中Th1細(xì)胞因子IL-18 mRNA表達(dá)水平,明顯低于人類肝細(xì)胞株QSG-7701，見圖1，且其正調(diào)節(jié)基因PR-3 mRNA表達(dá)水平也一樣，mRNA相對表達(dá)量比較同樣存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01和P<0.001)，見表2。但正調(diào)節(jié)基因(caspase-1，ICE)和負(fù)調(diào)節(jié)基因(caspase-3)mRNA相對表達(dá)量，2種人類肝癌細(xì)胞株和人類肝細(xì)胞株間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。而在2種人類肝癌細(xì)胞株間，無論是IL-18還是其正負(fù)調(diào)節(jié)基因mRNA的表達(dá)水平，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

我國是原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率均較高的國家之一。目前原發(fā)性肝癌最常用的治療方式是手術(shù)、放療和化療以及依據(jù)病情不同而進(jìn)行的綜合治療，然而總的治療效果并不理想。自從1990年首例基因治療開展以來，肝癌的基因治療逐漸成為生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一[3]。細(xì)胞因子具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，通過刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,增強(qiáng)機(jī)體識別腫瘤細(xì)胞的能力，以達(dá)到高效殺傷效應(yīng)。因此將細(xì)胞因子基因(TNF-α、IL-12等)導(dǎo)入肝癌患者體內(nèi)以達(dá)到抑制和治療腫瘤的治療手段在肝癌的免疫基因治療中有重要地位[4,5]。

IL-18作為Th1細(xì)胞因子，主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的。有活性的成熟IL-18在人類表皮角質(zhì)細(xì)胞和肺/腸上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富[6]。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)在正常卵巢上皮中表達(dá)有活性的IL-18，而在卵巢癌組織與細(xì)胞系中缺如，這可能是由于不表達(dá)IL-18，或是不共表達(dá)ICE。這一類似的現(xiàn)象同樣存在人類結(jié)腸癌、頭頸鱗癌以及B淋巴細(xì)胞癌中[8]。隨后對人類卵巢癌細(xì)胞進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)了1種突變IL-18，這種突變的IL-18分子上ICE作用位點(diǎn)N端的4個氨基酸缺失，致使其不能被ICE酶切成熟IL-18，而突變IL-18在正常細(xì)胞中并沒有被發(fā)現(xiàn)，表明這可能是腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)IL-18功能的1種機(jī)制[9]。

表2 人肝細(xì)胞株和2種肝癌細(xì)胞株中IL-18及其調(diào)節(jié)基因mRNA相對表達(dá)量

**和***分別為2種肝癌細(xì)胞株(MHCC97-L或HCCLM3)與人肝細(xì)胞株QSG-7701比較，**為P<0.01，***為P<0.001

圖1 人肝細(xì)胞株和2種肝癌細(xì)胞株中IL-18及其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的RT-PCR結(jié)果

Chia等[10]采用免疫組化法，發(fā)現(xiàn)肝癌患者癌旁正常肝組織中IL-18表達(dá)水平明顯高于肝癌組織。為了進(jìn)一步的闡明肝癌細(xì)胞調(diào)節(jié)IL-18功能的分子機(jī)制，本研究選用1種來源于肝癌患者癌旁組織的正常肝細(xì)胞株和2種原發(fā)性肝癌細(xì)胞株作為研究對象，采用RT-PCR，分別檢測IL-18及其相關(guān)正負(fù)調(diào)節(jié)基因mRNA的表達(dá)情況。研究結(jié)果再次從基因水平上證實(shí)了，肝癌癌旁正常肝細(xì)胞中IL-18 mRNA表達(dá)水平明顯高于肝癌細(xì)胞。雖然在IL-18主要的正調(diào)節(jié)基因ICE和負(fù)調(diào)節(jié)基因caspase-3 mRNA的表達(dá)上無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與肝癌細(xì)胞株相比，癌旁正常肝細(xì)胞株的另一個正調(diào)節(jié)基因(粒細(xì)胞蛋白水解酶，PR-3)mRNA的表達(dá)水平較高，這一結(jié)果暗示PR-3表達(dá)量的減少，可能是導(dǎo)致肝癌細(xì)胞IL-18表達(dá)缺失的原因之一。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)在粒細(xì)胞蛋白水解酶(PR-3)mRNA的表達(dá)上，肝癌細(xì)胞明顯低于癌旁正常肝細(xì)胞，這可能是肝癌細(xì)胞調(diào)節(jié)IL-18功能的重要機(jī)制之一。本研究結(jié)果也暗示IL-18或PR-3可能為基因治療原發(fā)性肝癌提供一個新的潛在的分子靶點(diǎn)。

[1]Bazan JF，Timans JC，Kastelein RA.A newly defined interleukin-1? 〔J〕.Nature，1996，379(6): 591.

[2]Fantuzzi G，Dinarello CA.Interleukin-18 and interleukin-1 beta: two cytokine substrates for ICE (caspase-1)〔J〕.J Clin Immunol，1999，19(1):01.

[3]Kamohara Y，Kanematsu T.Treatment of liver cancer: current status and future prospectives〔J〕.Gan To Kagaku Ryoho，2000，27:987.

[4]Cao G，Kuriyama S，Du P，et al.Complete regression of established murine hepatocellular carcinoma by in vivo TNF-α gene transfer〔J〕.Gastroenterology，1997，113(2): 501.

[5]Waehler R，Ittrich H，Mueller L，et al.Low-dose adenoviral immunotherapy of rat hepatocellular carcinoma using single-chain IL-12〔J〕.Hum Gene Ther，2005，16(3): 307.

[6]Okamura H，Tsutsui H，Komatsu T，et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN-γ〔J〕.Nature，1995，378:88.

[7]Wang ZY，Gaggero A，Rubartelli A，et al.Expression of interleukin-18 in human ovarian carcinoma and normal ovarian epithelium: evidence for defective processing in tumor cells〔J〕.Int J Cancer，2002，98(6):873.

[8]Lorey SL，Huang YC，Sharma V.Constitutive expression of interleukin-18 and interleukin-18 receptor mRNA in tumour derived human B-cell lines〔J〕.Clin Exp Immunol，2004，136(3): 456.

[9]Gaggero A，De Ambrosis A，Mezzanzanica D，et al.A novel isoform of pro-interleukin-18 expressed in ovarian tumors is resistant to caspase-1 and -4 processing〔J〕.Oncogene，2004，23(45):7552.

[10]Chia CS，Ban K，Ithnin H，et al.Expression of interleukin-18，interferon-gamma and interleukin-10 in hepatocellular carcinoma〔J〕.Immunol Lett，2002，84(3):163.