翁仕強, 趙 勇, 潘迎捷, 盧 瑛

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

基于特異性基因的副溶血性弧菌快速分離鑒定

翁仕強, 趙 勇, 潘迎捷, 盧 瑛

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海洋環(huán)境中常見的食源性致病菌。采用自行設(shè)計的改良初篩方案結(jié)合tlh、toxR這2種特異性基因的2次篩選開發(fā)了一種副溶血性弧菌的快速分離鑒定方法。應(yīng)用該法從海水、海泥及3種海產(chǎn)品中分離得到了19株副溶血性弧菌,再經(jīng)16S rDNA測序?qū)Ψ蛛x鑒定結(jié)果的特異性進行了驗證。實驗結(jié)果顯示基于tlh、toxR這兩種特異性基因分離鑒定所得19株菌的準確性為100%,全程檢測時間為3 d。上述結(jié)果顯示本研究開發(fā)的基于特異性基因的副溶血性弧菌分離鑒定法是一種高效、快速的檢測方法,特異性強且耗時短,在食源性致病菌的風險評估和大規(guī)模樣本的分析檢測領(lǐng)域具有較高的潛在應(yīng)用價值。

副溶血性弧菌;特異性基因;tlh;toxR;鑒定

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,簡稱V.parahaemolyticus或V p)是一種革蘭氏陰性的嗜鹽微生物,屬于弧菌屬,是沿海地區(qū)常見的一種食源性致病菌,能夠引起人類腸胃炎[1],同時也能感染魚、蝦、蟹類以及甲殼類等多種水產(chǎn)動物,對其養(yǎng)殖帶來不利[2-3]。它主要存在于海水環(huán)境中,如海產(chǎn)魚、蝦、貝類以及海水、海泥等。副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在世界各地區(qū)頻繁發(fā)生,以沿海城市為主[4]。目前,副溶血性弧菌的傳統(tǒng)分離鑒定流程為:樣品先經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)增菌,然后用副溶血性弧菌的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)分離純化出單菌落,最后經(jīng)一系列的生理生化鑒定來確定分離菌是否為副溶血性弧菌。因為弧菌屬的多種細菌在分類學上與副溶血性弧菌很相近,它們的生理生化鑒定結(jié)果很相像,因此傳統(tǒng)的分離鑒定方法有假陽性反應(yīng),在可靠性方面有所欠缺,此外整個流程耗時長,一般需要5～7 d。

PCR方法應(yīng)用于檢測環(huán)境中的微生物有助于提高檢測的迅速性和準確性。研究顯示,副溶血性弧菌中的tlh、toxR基因具有特異性保守片段[5-7],可用于設(shè)計PCR的特異性引物,其中tlh基因編碼副溶血性弧菌的不耐熱溶血毒素(TLH),所有的副溶血性弧菌都有該基因,因此tlh基因具有種特異性,目前國內(nèi)外研究者在開發(fā)副溶血性弧菌的PCR檢測技術(shù)時大都選用該基因。toxR基因最早是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn),后來研究人員發(fā)現(xiàn)toxR基因在副溶血性弧菌中也存在,主要起調(diào)控基因的功能[8]。本研究采用自行設(shè)計的改良初篩方案結(jié)合tlh、toxR這兩種特異性基因的2次篩選方法開發(fā)了一種副溶血性弧菌的快速分離鑒定方法,為今后副溶血性弧菌的大規(guī)模分離純化及高通量式快速分離鑒定方法的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株:副溶血性弧菌標準菌株A TCC 33846,購自中國科學院微生物研究所;樣品:海泥、海水、蟹和黃泥螺于2009年6月采自上海市臨港新城東海大橋附近灘涂,蛤蜊于2009年5月購自上海新蘆苑集貿(mào)市場;培養(yǎng)基及試劑:堿性蛋白胨水(APW)自行配制,硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂(TCBS)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB),三糖鐵(TSI)瓊脂購自北京陸橋公司,TaqDNA聚合酶購自TA KARA公司,D2000 DNA Ladder Marker購自貝博公司;主要儀器:Stomacher 細菌分離器:德國 Eppendorf公司產(chǎn)品,UVP EC3凝膠成像系統(tǒng):美國UVP產(chǎn)品,Eppendorf A G PCR儀等:法國 Intersecince產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 副溶血性弧菌的分離方法 各取海水25 m L、海泥25 g,分別加至225 m LAPW培養(yǎng)基中,混勻后放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng);食物樣品無菌操作各取25 g,分別放入均質(zhì)袋中,各加入225 m L APW培養(yǎng)基,然后放入均質(zhì)器(Stomacher 細菌分離器)中拍打2 min(拍打速度為6次/s)后,扎好袋口置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。次日取上述2種培養(yǎng)液于含3 g/dL NaCL的 TCBS平板上劃線分離,37℃過夜培養(yǎng)。挑取TCBS平板上的綠色或藍綠色可疑單菌落劃線于3 g/dL NaCl TSA平板上純化培養(yǎng)后做下一步鑒定。上述實驗均在無菌超凈臺中進行。

1.2.2 副溶血性弧菌的鑒定 首先采用3 g/dL NaCl TSI試驗進行初篩,然后將TSI試驗現(xiàn)象符合的可疑菌落采用PCR擴增tlh與toxR基因以確定副溶血性弧菌,最后對含tlh、toxR2種基因的分離菌進行16S rDNA測序進行驗證。

1)TSI試驗 挑取3 g/dL NaCl TSA平板上的純培養(yǎng)菌落接種于3 g/dL NaCl TSI斜面(底部穿刺,斜面劃線),37℃培養(yǎng)過夜。底部變黃,斜面變紅,不產(chǎn)氣泡為副溶血性弧菌的試驗現(xiàn)象。

2)菌株總DNA的提取 DNA提取采用熱裂解法,刮取一環(huán)3 g/dL NaCl TSI斜面上可疑菌落培養(yǎng)物接至100μL 3 g/dL生理鹽水中,懸浮后10 000 g離心10 min,除去上清。在沉淀中加入100 μL無菌NaOH(50 mmol/L),重懸后100℃加熱處理10 min。然后取50μL處理液,加入8μL Tris-HCl(1 mol/L,p H值為7.0)中和p H值后10 000 g離心10 min,取上清(即DNA模板)-20℃保存。

3)tlh、toxR基因的PCR擴增及其特異性表征

PCR引物見表1,擴增條件見表2。tlh、toxR2種基因PCR擴增產(chǎn)物的特異性表征采用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合16S rDNA測序方式,測序結(jié)果首先在NCBI上進行基因比對,然后通過M EGA 4軟件構(gòu)建包括19株分離菌、9株弧菌以及2株非弧菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌分離鑒定結(jié)果

從TCBS選擇性培養(yǎng)基上挑取28株藍綠色菌落,所有菌落均先劃線于 TSA平板上純化培養(yǎng)后再做鑒定實驗。

表1 tlh、toxR基因的擴增引物Tab.1 Oligonucleotide primers of tlh gene and toxR gene

表2 tlh、toxR基因的PCR擴增條件Tab.2 Amplification profiles of PCR

2.1.1 TSI試驗結(jié)果 28株分離菌的 TSI試驗顯示,有23株與對照的標準菌株一樣顯示底部變黃,斜面變紅,不產(chǎn)氣泡現(xiàn)象,因此我們選取了這23株疑似副溶血性弧菌進行后續(xù)的PCR鑒定。

2.1.2tlh、toxR基因的 PCR擴增結(jié)果 23株副溶血性弧菌疑似菌的tlh基因擴增結(jié)果見圖1。由圖1可知,有19株分離菌在450 bp附近處擴增出與標準菌株一致的基因片段,與預(yù)期的tlh基因片段大小吻合,說明這19株分離菌含有tlh基因。隨后我們選取這19株含tlh基因可疑菌株進行了toxR基因的PCR擴增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這19株分離菌在368 bp附近處均擴增出與標準菌株一致的基因片段(見圖2),該片段大小與預(yù)期的toxR基因相吻合。

圖1 PCR擴增分離菌株 tlh基因電泳圖譜Fig.1 PCR profiles of tlh gene of suspectable strains isolated from samples

圖2 PCR擴增分離菌株toxR基因電泳圖譜Fig.2 PCR profiles of toxR gene of suspectable strains

2.1.3 16S rDNA測序驗證 以含有tlh和toxR基因的19株菌為對象,擴增了這19株分離菌的16S rDNA,然后送上海桑尼生物科技有限公司測序,再進行序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。測序結(jié)果顯示,這19株分離菌與副溶血性弧菌的序列相似度為99%～100%。以這19株分離菌和11株已知菌的16S rDNA序列比對并通過M EGA 4軟件分析建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3),系統(tǒng)發(fā)育樹顯示這19株分離菌與副溶血性弧菌的遺傳距離最近。上述結(jié)果顯示,這19株含有tlh和toxR基因的分離菌均為副溶血性弧菌。

3 結(jié) 語

目前,食源性致病菌的檢測正朝著快速、靈敏、特異性強、成本低的方向發(fā)展,目前在我國的食品工業(yè)領(lǐng)域,食源性致病菌的檢測以傳統(tǒng)的生理生化分離鑒定方法為主,一般需要7 d左右,耗時長,步驟多,給質(zhì)控和監(jiān)控部門帶來很大的不便性。Ying Bu Kim等[7]用373株已確定的副溶血性弧菌分別做理化鑒定和PCR鑒定,結(jié)果顯示理化結(jié)果有47株顯示為陰性,而PCR鑒定結(jié)果全為陽性。由此可見,PCR分離鑒定方法準確性較高。本研究采用國標GB/T 4789.7-2008的增菌方法結(jié)合改良式初篩和PCR擴增特異性基因的方法來分離鑒定海水環(huán)境中的副溶血性弧菌。首先,我們利用副溶血性弧菌的嗜鹽性設(shè)計了選擇性培養(yǎng)基(3 g/dL NaCl的TCBS)結(jié)合三糖鐵理化試驗進行可疑菌株的初篩,之所以在初篩中選擇三糖鐵試驗是因為我們經(jīng)過多次分菌篩選發(fā)現(xiàn)三糖鐵試驗的結(jié)果對副溶血性弧菌的篩選性能最好。初篩結(jié)束后,選取了副溶血性弧菌的tlh和toxR這2種特異性基因進行PCR擴增對可疑菌株進行2次篩選,最后通過測序比對來驗證基于這2種基因的2次篩選結(jié)果的準確性。實驗結(jié)果顯示初篩時選取的可疑菌株其準確率為82.6%。初篩后再經(jīng)副溶血性弧菌的tlh和toxR這2種特異性基因的2次篩選,測序比對分析后發(fā)現(xiàn)其準確性為100%,說明本研究所選用的引物特異性強,可靠性高。

圖3 M EGA4軟件構(gòu)建的19株分離菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the 19 isolated strains structure by MEGA4

副溶血性弧菌的特異性基因有:tlh基因、gyrB基因、Fla基因、toxR基因等。它們在副溶血性弧菌弧菌中均有一定的保守性。另外,還有研究者設(shè)計耐熱直接溶血素基因(tdh)的特異性PCR引物,用于分離致病性副溶血性弧菌[10]。作者所在研究室過往在以tlh基因鑒定副溶血性弧菌時曾發(fā)現(xiàn)有2株分離菌 PCR檢測時為tlh陽性,但經(jīng)16S rDNA測序比對后發(fā)現(xiàn)是哈維氏弧菌。故此,本研究在2次篩選時選用了tlh與tox R2種基因進行PCR檢測以確保高準確性,同時因為準確性有了雙重保險,建議實際應(yīng)用時可以省略測序過程以減低檢測成本。

綜上所述,相較于傳統(tǒng)的理化分離鑒定法,本研究開發(fā)的基于特異性基因的副溶血性弧菌快速分離鑒定法檢測特異性強且耗時短、成本低,整個過程包括分離、純化、鑒定,耗時3 d,檢測結(jié)果準確性高,是一種快速簡便且高效的方法(見圖4)。

圖4 傳統(tǒng)方法與本研究的PCR方法流程圖Fig.4 Flow chart of conventional isolation and PCR method in our study

若結(jié)合全自動核酸提取儀,今后還可以在此方法的基礎(chǔ)上進一步開發(fā)副溶血性弧菌的高通量檢測方法,在食源性致病菌的風險評估和大規(guī)模樣本的分析檢測領(lǐng)域具有較高的潛在應(yīng)用價值。

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Rapid Isolation and Identification Method Based on Specific Gene for Vibrio parahaemolyticus

WENG Shi-qiang, ZHAO Yong, PAN Ying-jie, LU Ying
(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Vibrio Parahaemolyticusis a frequent food-borne pathogen in marine environments.A rapid isolation and identification method for Vibrio Parahaemolyticus was developed in this study by combining an imp roved screening method with a second screening based on specific genes(tlhandtox R).By using this method,19 strains ofVibrio parahaemolyticuswere isolated from marine water,ooze and threemarine products.Also,the 16S rDNA from the isolated strains was sequenced to validate the specificity.The results obtained by the specifictlh,toxRgene identification method were consistent with that from 16S rDNA sequencing,show n that the veracity of the identification method based on specific gene is 100%.Our results appeared that the isolation and identification method based on specific genes forVibrio parahaemoly ticusis an efficient and rapid method,which has high specificity and is timesaving,only need 3 days.It would be high potential application in the field of risk assessment of food-borne pathogens and of the large-scale detection researches.

Vibrio parahaemolyticus,specific gene,tlh,toxR,identification

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盧瑛(1971-),女,浙江東陽人,理學博士,副教授,主要從事食品安全與風險評估、納米生物技術(shù)等方面研究。Email:y-lu@shou.edu.cn

S 37

A

1673-1689(2011)03-0417-05

book=421,ebook=478

2010-05-22

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2008BAD94B09);上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目(09YZ274);上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目;上海市教育委員會重點學科建設(shè)項目(J50704)。