張巧艷，何騰飛，范萍，平麗英，周育

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，杭州 310021；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014；3.中美華東制藥有限公司發(fā)酵工程實驗室，杭州 310011）

乳制品常見致病菌選擇性共增菌技術(shù)研究

張巧艷1，何騰飛2，范萍3，平麗英3，周育1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，杭州 310021；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014；3.中美華東制藥有限公司發(fā)酵工程實驗室，杭州 310011）

以乳制品常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為目標菌，研究6種基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2種培養(yǎng)模式、20種培養(yǎng)基添加劑對增菌的影響，并以無顯著抑制效應(yīng)的添加劑對背景微生物進行了抑菌效應(yīng)研究，建立了一種選擇性富集目標菌的ESS培養(yǎng)基。使用該培養(yǎng)基37℃靜止培養(yǎng)16 h，可實現(xiàn)目標菌的共增菌，對可能影響目標菌檢測的乳制品中其他致病菌有一定抑制效果。

選擇性富集培養(yǎng)基；大腸桿菌；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；抑菌劑

0 引言

大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌常常同時污染乳制品，是引起食物中毒最常見的病原菌。大腸桿菌主要導(dǎo)致腹瀉和泌尿道感染。沙門氏菌可導(dǎo)致自愈性胃腸炎，重者可引起致死性傷寒。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌。多重PCR可在同一檢測平臺上快速檢測多種致病菌。當乳制品受污染程度較低時，為防止漏檢，需要進行增菌培養(yǎng)；當背景微生物較多時，采用選擇性增菌技術(shù)，可提高多重PCR檢測的準確性。

國內(nèi)外選擇性共增菌培養(yǎng)基主要有：SVV[1]、SSL[2]和SEL[3]等。許一平[4]等報道的BSB培養(yǎng)基具有共增菌效果，但不具有選擇性。本研究針對乳制品中常見致病菌，探索一種能夠選擇性富集大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的共增菌技術(shù)，為以后建立多重PCR共檢平臺提供支撐。

1 實驗

1.1 材料

菌種：Y-1為大腸桿菌（Escherichia coli）（CMCC 44102），Y-2為腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）（CMCC 50041），Y-3為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CICC 21600），Y-5為福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）（CMCC 51571），Y-6為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）（CMCC 63301），Y-17為單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）（CICC 21633），Y-19為普通變形桿菌（Proteus vulgaris）（CMCC 49027）。Y-1，Y-2，Y-5均購自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心；Y-3，Y-17均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；Y-6為本實驗室保藏菌種；Y-19購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

化學(xué)試劑均為分析純，牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、葡萄糖等生物試劑均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

將供試菌分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接2次后用無菌生理鹽水梯度稀釋，接種時控制接種量為10～100 mL-1。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

以Y-1，Y-2，Y-3為目標菌，將它們分別各自接入LB，NB，BPW，UPB[5]，TSB，BSB中；37℃以150 r/min振蕩培養(yǎng)8，16，24 h；進行平板計數(shù)。

1.2.3 培養(yǎng)模式的選擇

將目標菌分別各自接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)和150 r/min搖瓶培養(yǎng)同步進行，分別培養(yǎng)8，16，24 h，測定OD600值和進行平板計數(shù)。

1.2.4 添加劑的選擇

將目標菌分別各自接入含有不同添加劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以接入不含添加劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為陽性對照，37℃培養(yǎng)一定時間，測定OD600值，按下式計算抑制率。

以Y-5，Y-6，Y-17，Y-19為背景微生物，選擇對目標菌無顯著抑制效應(yīng)的添加劑，按目標菌的方法進行實驗，測定OD600值，計算抑制率，最終確定選擇性共增菌培養(yǎng)基的組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

將目標菌Y-1、Y-2和Y-3分別接入6種非選擇性培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)，結(jié)果見圖1～圖3所示。由圖1～圖3可以看出，培養(yǎng)8 h，BSB基本使3種目標菌同步生長，但增菌量極低，未能達到多重PCR的最低檢測限。其它5種培養(yǎng)基對3種目標菌的平行增菌效果差異較大，最大增菌量與最小增菌量的比值均大于100。若共增菌培養(yǎng)僅8 h，可能培養(yǎng)過程處于生長優(yōu)勢的菌會對其它目標菌產(chǎn)生抑制，最終造成漏檢。培養(yǎng)16 h，LB和TSB的增菌效果相當，總體上略勝于NB和UPB，但這4種廣譜增菌培養(yǎng)基均能使3種目標菌菌量達到108mL-1以上，且從16 h至24 h，菌量幾乎沒有顯著增長。可見，LB，TSB，NB和UPB增菌效果較好，培養(yǎng)16 h就能使3種目標菌均基本進入穩(wěn)定期。

TSB特別有利于Y-1的生長，培養(yǎng)8 h，使其處于生長高峰，以后進入穩(wěn)定期和衰退期。過早的增殖不利于3種目標菌的同步生長。UPB曾被用于沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特氏菌的同步富集培養(yǎng)[5]，顯然它對Y-1，Y-2和Y-3的各自增菌效果也較好，但沒有顯著優(yōu)勢，且成分相對復(fù)雜。BPW目前主要用于沙門氏菌、單增李斯特氏菌和阪崎腸桿菌的前增菌培養(yǎng)。用BPW培養(yǎng)目標菌16 h，對桿菌（Y-1和Y-2）的增菌效果顯著優(yōu)于球菌（Y-3）。BSB在整個培養(yǎng)過程中增菌效果均不如其它培養(yǎng)基，可能與氯化鈉濃度較高有關(guān)，也反映了不同菌對鹽的耐受性不同。LB和NB成分均較簡單，但培養(yǎng)后期LB增菌效果均略優(yōu)于NB。這里選擇LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 培養(yǎng)模式的選擇

選擇性富集培養(yǎng)基SVV[1]，SSL[2]和SEL[3]共增菌過程均采用搖瓶培養(yǎng)模式。搖瓶培養(yǎng)可保證好氧菌獲得充足的溶解氧，從而快速生長。Y-1，Y-2和Y-3均為兼性厭氧菌，在有氧和無氧環(huán)境中均能生長。將目標菌各自接入LB中，分別進行靜止培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，培養(yǎng)8 h，無論在靜止狀態(tài)下，還是在搖瓶狀態(tài)下，Y-1生長速度顯著優(yōu)于Y-2和Y-3。培養(yǎng)16 h，搖瓶狀態(tài)下3種目標菌的菌量均為靜止時的10倍左右，且比靜止時提早進入穩(wěn)定期。培養(yǎng)24 h，搖瓶培養(yǎng)和靜止培養(yǎng)對Y-3的影響最顯著，可能由于該菌為需氧或兼性厭氧菌，在培養(yǎng)后期有氧代謝更易使其獲得能量，促進生長。

雖然在整個培養(yǎng)過程中搖瓶培養(yǎng)更有利于3種目標菌的生長，但是培養(yǎng)16 h和24 h，目標菌菌量增加較少，而OD600值卻仍顯著增加，可能有氧代謝產(chǎn)物干擾了OD600值反映菌量的關(guān)系。靜止培養(yǎng)16 h，3種目標菌均處于對數(shù)生長后期，此時細胞分裂仍較活躍，對添加劑的促進或抑制較敏感，可通過OD600值的變化來反映添加劑的作用。熒光假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、炭疽桿菌等乳制品中可能的污染菌為專性好氧菌，在靜止條件下基本不能生長?？漳c彎曲菌為微需氧菌，肉毒梭菌為專性厭氧菌，它們雖然會污染乳制品，但靜止培養(yǎng)仍有一定量的氧氣存在，不利于該類菌生長而干擾目標菌的檢測。而且搖瓶培養(yǎng)消耗動能，增加成本。所以以后采取靜止培養(yǎng)模式，培養(yǎng)時間為16 h。

將3種目標菌同時接入LB中，靜止培養(yǎng)16 h，用Baird-Parker瓊脂平板和WS瓊脂平板分別計數(shù)（BP平板上Y-3為黑色菌落，其他兩菌不生長；WS平板上Y-1為桔黃色菌落，Y-2為藍綠色菌落，Y-3不生長。）。Y-1和Y-2菌落數(shù)均接近于108mL-1，Y-3僅能達到106mL-1，滯后于Y-1和Y-2至少10倍以上。以后可通過添加促進劑或抑制劑來控制3種目標菌的生長速度。

2.3 添加劑的選擇

2.3.1 添加劑對目標菌的作用

將各種添加劑以不同濃度分別加入LB中，研究它們對3種目標菌的促進或抑制效應(yīng)，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，糖、醇類物質(zhì)提供微生物生長所需的碳源。Y-1可利用乳糖進行發(fā)酵，乳糖的存在大大促進其生長，但對Y-2和Y-3的促進效果不顯著。阿卡波糖顯著抑制Y-3的生長，可能與其抑制α-葡萄糖苷酶活力，影響Y-3對碳源的利用有關(guān)。水楊素對3種目標菌無顯著抑制作用。甘露醇顯著促進3種目標菌的生長。

維生素類物質(zhì)常作為某些菌的生長因子，參與細胞代謝。煙酰胺是NADH和NADPH的前體，具有抗炎作用。煙酰胺對目標菌作用緩和，只有當質(zhì)量濃度較高時，才表現(xiàn)出對Y-2和Y-3一定的抑制效應(yīng)。對氨基苯甲酸是葉酸的前體。當它濃度較低時，對Y-1有較強的促進作用，對Y-2和Y-3作用不明顯；隨著濃度的增加，抑制效果顯著增加；當質(zhì)量濃度為0.50 g/100 mL時，3種目標菌幾乎完全被抑制?？赡苡捎趯Π被郊姿岷铣扇~酸后引起核蛋白合成受阻，從而達到抑菌的效果。

據(jù)報道，許多鹽類物質(zhì)對細菌有選擇性抑制作用。由表2可知，亞硫酸鈉、檸檬酸鈉、十二烷基硫酸鈉、硫代硫酸鈉均強烈抑制Y-3的生長。較低濃度氯化鈉對Y-3的生長略有促進作用；當質(zhì)量濃度較高時，Y-3略受抑制，但能耐高鹽維持生長，而Y-1和Y-2受到強烈抑制。金黃色葡萄球菌能通過細胞內(nèi)積累甜菜堿來適應(yīng)培養(yǎng)基中的高鹽環(huán)境[6]。氯化鋰和亞碲酸鉀常用于抑制非葡萄球菌的微生物。實驗結(jié)果表明，氯化鋰對Y-3略有促進作用，當質(zhì)量濃度較高時，抑制Y-1的生長。亞碲酸鉀對3種目標菌無顯著抑制作用。檸檬酸鐵銨主要作為乳制品、小麥粉等的營養(yǎng)增補劑，亦用于細菌培養(yǎng)基。表2所示，檸檬酸鐵銨對Y-2略有促進作用，當質(zhì)量濃度較高時，對Y-3有一定抑制作用。硫氰酸鉀曾被用作乳制品的非法保鮮劑，它對3種目標菌無顯著抑制效果。磷酸氫二鉀為細胞代謝提供緩沖，避免細菌產(chǎn)酸導(dǎo)致pH值大幅下降而影響生長。當磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為0.10 g/100 mL時，對3種目標菌無顯著影響；當質(zhì)量濃度為0.50 g/100 mL時，強烈抑制Y-3的生長；當質(zhì)量濃度為1.00 g/100 mL時，對3種目標菌均有較強的抑制作用?？梢?，磷酸鹽質(zhì)量濃度過高，也不利于細菌生長，可能與細胞壁結(jié)構(gòu)和電子傳遞體系有關(guān)。

表1 靜止培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)對目標菌增菌的影響

表2 添加劑對目標菌增菌的影響

膽鹽類物質(zhì)通常用于抑制革蘭氏陽性菌。實驗結(jié)果證實，5號膽鹽強烈抑制革蘭氏陽性的Y-3，對革蘭氏陰性的Y-1、Y-2作用不顯著。去氧膽酸鈉質(zhì)量濃度較低時，對目標菌的作用不顯著；質(zhì)量濃度較高時（0.20 g/100 mL），抑制Y-3的生長，且抑制作用強于5號膽鹽。這兩種膽鹽對Y-2都略有促進作用。此外，一些抗生素具有抑菌和殺菌活性。磷霉素可抑制細菌細胞壁的早期合成。多粘菌素B可增加細胞的通透性。這兩種抗生素強烈抑制3種目標菌的生長（表2）。

抑菌劑抑制效果有濃度依賴性。為了使3種目標菌在共增菌時能夠盡量達到較一致的生長速度，選擇水楊素、甘露醇、煙酰胺、氯化鈉、氯化鋰、亞碲酸鉀、檸檬酸鐵銨、硫氰酸鉀、磷酸氫二鉀、去氧膽酸鈉為目標添加劑，進一步研究它們對背景微生物的作用。

2.3.2 目標添加劑對背景微生物的作用

選擇對3種目標菌無顯著抑制效應(yīng)的濃度，將各種目標添加劑分別加入LB中，研究它們對Y-5，Y-6，Y-19的抑制作用，結(jié)果見表3。水楊素濃度較高時對Y-6有較顯著抑制作用，但對Y-19有一定促進作用?？紤]到水楊素對Y-3也有一定抑制作用（表2），共增菌時Y-3本身滯后于Y-1和Y-2，選擇水楊素不利于目標菌的同步增菌。甘露醇對Y-5有較顯著促進作用，對Y-6有一定抑制作用。由于甘露醇對目標菌均有促進作用（表2），有利于目標菌的復(fù)活和快速生長，選擇添加質(zhì)量濃度為1.00 g/100 mL。煙酰胺對Y-5，Y-6和Y-19均無明顯抑制作用。質(zhì)量濃度為2.00 g/100 mL氯化鈉和0.20 g/100 mL氯化鋰對Y-5和Y-6均有一定抑制作用。由于它們都對Y-3略有促進作用（表2），還可用于調(diào)整Y-1和Y-2對Y-3的生長優(yōu)勢抑制。亞碲酸鉀對Y-5，Y-6和Y-19的抑制效果與目標菌（表2）相當。檸檬酸鐵銨、硫氰酸鉀對Y-19略有促進作用，對Y-5和Y-6有一定抑制作用。但由于檸檬酸鐵銨在堿性環(huán)境中容易發(fā)生沉淀；而當硫氰酸鉀與其相遇時，它們也會發(fā)生反應(yīng)，影響抑菌效果。低濃度硫氰酸鉀更有利于Y-3的增殖（表2）。兩者之中選擇質(zhì)量濃度為0.05 g/100 mL硫氰酸鉀作為添加劑。質(zhì)量濃度為0.10 g/100 mL磷酸氫二鉀對Y-5和Y-6有一定抑制效果。質(zhì)量濃度為0.05 g/100mL去氧膽酸鈉對Y-6有較顯著抑制作用，但它同時對Y-3有一定抑制作用；較低濃度時，對Y-6仍有一定抑制作用，對Y-3略有促進作用。選擇其添加濃度為0.01 g/100 mL。所有目標添加劑對Y-19抑制效果均不顯著。

將Y-17接入LB中，靜止培養(yǎng)16 h，測得的OD600值接近于0，不適宜計算抑制率。用平板計數(shù)獲得此時菌量為106mL-1，顯著低于3種目標菌（表1）。篩選獲得的選擇性添加劑中硫氰酸鉀、去氧膽酸鈉對Y-17有一定抑制作用，質(zhì)量濃度為0.05 g/100 mL硫氰酸鉀抑制效果較好，可使Y-17菌量降低100倍。而檸檬酸鐵銨對Y-17幾乎沒有抑制效果。

表3 目標添加劑對背景微生物增菌的影響

3 結(jié)論

以乳制品中常見致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌為目標菌，建立了一種選擇性共增菌技術(shù)。該技術(shù)采取37℃靜止培養(yǎng)模式，培養(yǎng)時間為16 h，選擇性培養(yǎng)基組成為（g/100mL）：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，氯化鈉2.0，甘露醇1.0，氯化鋰0.2，硫氰酸鉀0.05，去氧膽酸鈉0.01，磷酸氫二鉀0.10；pH值為7.0。使用該技術(shù)可同時富集大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，對乳制品中可能存在的其他微生物有一定的抗干擾能力，為以后提高多重PCR快速檢測這3種菌的靈敏度和準確性提供了保障。

[1]覃倚瑩,吳暉,肖性龍,等.選擇性富集沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌的共增菌培養(yǎng)基SVV[J].生物工程學(xué)報,2009,25(10):1497-1507.

[2]劉園園,肖性龍,余以剛,等.一種能同時富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的培養(yǎng)基[J].微生物學(xué)報,2009,49(10): 1389-1396.

[3]KIM H,BHUNIA A K.SEL,a Selective Enrichment Broth for Simultaneous Growth of Salmonella enterica,Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes[J].Applied and Environmental Microbiology,2008,74(15):4853-4866.

[4]許一平,陳福生.一種能同時富集沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)基[J].微生物學(xué)通報,2007,34(2):208-211.

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Selective enrichment technology for three main pathogenic bacteria from dairy products

ZHANG Qiao-yan1,HE Teng-fei2,FAN Ping3,PING Li-ying3,ZHOU Yu1
(1.Institute of Quality and Standard for Agricultural Products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;2.College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China;3. Fermentation engineering laboratory,Sino-us east China pharmaceutical Co.,Hangzhou 310011,China)

The enrichment effect of 6 basic media,2 culture methods and 20 medium additives onEscherichia coli,Salmonella enteritidisandStaphylococcus aureusfrom dairy products were evaluated respectively by conventional detection methods.In order to suppress interference detection from other bacteria,10 additives which had no remarkable inhibitory effect on the three target bacteria were selected to study their actions on other pathogenic bacteria such as Shigella flexneri,Bacillus cereusand so on.A new selective enrichment broth(ESS)was formulated to allow a good recovery of the three target pathogens and a more acceptable inhibition of the interference bacteria within 16 h of still incubation at 37℃.

multi-pathogen selective enrichment broth;Escherichia coli;Salmonella enteritidis;Staphylococcus aureus;bacteriostat

TS252.1

A

1001-2230（2011）05-0026-05

2011-02-21

浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目（2010C32024）。

張巧艷（1978-），女，助理研究員，從事微生物檢測技術(shù)研究。

周育