郭洪波，林葉，李慶章，邊艷杰，肖陽

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

奶牛乳腺中瘦素及其受體的表達(dá)與定位

郭洪波，林葉，李慶章，邊艷杰，肖陽

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

為探討瘦素在奶牛乳腺發(fā)育、泌乳及退化各時期的表達(dá)變化規(guī)律及在乳腺組織中的具體位置，采用免疫印跡（westernblotting）技術(shù)及激光共聚焦技術(shù)檢測奶牛乳腺組織中瘦素及瘦素受體（OB-Rb）的表達(dá)變化及其定位。結(jié)果表明，瘦素在青春期表達(dá)量較高，在泌乳期表達(dá)量最低。瘦素受體在青春期和妊娠期表達(dá)量較高，泌乳期表達(dá)量相對較低，退化期逐漸恢復(fù)到妊娠期水平。

奶牛；乳腺組織；瘦素；長型瘦素受體

0 引言

Zhang等[1]從遺傳性肥胖小鼠的脂肪組織中采用位置克隆技術(shù)首次克隆出小鼠的肥胖基因（ob基因），瘦素是ob基因的產(chǎn)物，主要由白色脂肪組織分泌的分子量為16 ku的蛋白質(zhì)[2]。瘦素受體屬于Ⅰ型細(xì)胞因子受體超家族成員,長型瘦素受體（OB-Rb）在瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主要作用。瘦素缺失或瘦素受體缺失的小鼠乳腺導(dǎo)管分支明顯減弱[3]。Lin等[4]發(fā)現(xiàn)瘦素可以促進(jìn)小鼠妊娠期乳腺導(dǎo)管細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)泌乳期β-酪蛋白基因表達(dá)，啟動退化期乳腺細(xì)胞凋亡并參與乳腺組織重建過程。李萌等[5]在研究瘦素對奶山羊乳腺相關(guān)功能影響實(shí)驗(yàn)中也得出上述結(jié)論。本研究采用western blotting技術(shù)及激光共聚焦技術(shù)檢測奶牛乳腺組織中瘦素及OB-Rb的表達(dá)變化及定位，為闡明瘦素及其受體在奶牛乳腺發(fā)育和泌乳過程中的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

澳大利亞荷斯坦奶牛奶牛按照實(shí)驗(yàn)要求在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場飼養(yǎng)，取材備用。

實(shí)驗(yàn)分期：青春期2個月，青春期12個月，青春期14個月;

妊娠期2個月，妊娠期4個月，妊娠期6個月；

泌乳期7日，泌乳期50日，泌乳期140日，泌乳期280日；

退化期3日，退化期30日。

上述n=3。

青春期奶牛乳腺組織取材：青春期是從出生之日開始算起，分別取青春期2個月、12個月、14個月奶牛乳腺，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

妊娠期奶牛乳腺組織取材：公牛和母牛交配次日記為妊娠1日，之后每隔3天用驗(yàn)孕試紙檢測是否妊娠，同時取材時通過腹腔解剖觀察子宮狀態(tài)進(jìn)一步鑒定是否妊娠，妊娠90 d后直接從外觀即可鑒定是否妊娠。分別取妊娠2個月、4個月、6個月奶牛乳腺，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

泌乳期奶牛乳腺組織取材：從分娩并開始泌乳日記為泌乳期，分別取泌乳7日、50日、140日、280日奶牛乳腺，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

退化期奶牛乳腺組織取材：泌乳結(jié)束后，即為自然退化3日、30日奶牛乳腺，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 試劑和儀器

試劑：Rabbit anti-bovine Ob（sc-842），Rabbit anti-bovine（Ob-R(H-300)，sc-8325），Goat anti–mouse FITC IgG sc-2092，Goat anti-rabbit IgG sc-2091，β-catemin mouse anti-bovine sc-2037，Mouse anti-bovine β-actin sc-47778，RAPI蛋白裂解液（P0013B），預(yù)染Marker（7～175ku），甲醇和冰乙酸等均為國產(chǎn)分析純試劑，硝酸纖維素膜，PX型醫(yī)用X-ray膠片，顯影液，定影液等。

u ER1，儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡（TCS SP2），半干轉(zhuǎn)移電泳儀，冰凍切片機(jī)，電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 乳腺組織總蛋白提取

乳腺組織切碎，稱重。1∶20倍加入苯甲基磺酰氟化物（PMSF）的RAPI裂解液對組織進(jìn)行勻漿，冰上靜置5 min，4℃下14 000 r/min離心15 min，收集上清液，進(jìn)行后續(xù)western blotting實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫印跡分析（westernblotting）

分別取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期奶牛乳腺組織提取總蛋白，瘦素分子量為16 ku，故選擇5%的濃縮膠和15%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，長型瘦素受體選擇5%的濃縮膠和8%的分離膠進(jìn)行SDSPAGE分析。電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，室溫用脫脂牛奶封閉2 h，用3 mL 1∶500稀釋的兔抗牛瘦素抗體4℃孵育過夜。取出后用TBST洗3次，每次5 min，再用3 mL 1∶5 000稀釋的HRP-雞抗兔IgG，37℃搖床孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min發(fā)光液顯色，在暗室中曝光、顯影。

1.2.3 乳腺中瘦素及其受體的表達(dá)定位

取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期奶牛乳腺組織制作冰凍切片，冷丙酮固定10 min后用PBS洗3次，每次10 min，10%山羊血清37℃孵育60 min，兔抗牛瘦素抗體4℃孵育過夜（抗體用PBS稀釋，稀釋比例1︰100）。取出后用PBS洗3次，每次5 min，F(xiàn)ITC-山羊抗兔IgG 37℃孵育60 min（稀釋比例1︰200），PBS洗3次，每次5 min，DAPI染核15 min，PBS洗3次每次5min，用DABCO封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

免疫組化：對奶牛每個時期切片3張進(jìn)行試驗(yàn)，每張切片選擇不同視野進(jìn)行觀察，掃描拍照。Western blotting結(jié)果用bandscan4.3軟件分析。所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一樣本不同處理的結(jié)果用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間應(yīng)用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺中瘦素及其受體的表達(dá)定量

圖1為瘦素，OB-Rb，內(nèi)參的Western blotting結(jié)果。圖1中，V，P，L，I分別表示青春期，妊娠期，泌乳期和退化期；m代表月，d代表日，下同。

圖2為奶牛乳腺中瘦素和OB-Rb的表達(dá)（P＜0.05）。由圖2可以看出，瘦素在青春期表達(dá)量最高，并逐漸降低；在整個妊娠期瘦素表達(dá)量變化很小，略有升高；泌乳期瘦素維持在低水平；退化期表達(dá)量顯著上調(diào)，到退化30 d瘦素表達(dá)量恢復(fù)到妊娠初期水平瘦素。

受體的表達(dá)量低于瘦素，表達(dá)變化規(guī)律與瘦素相類似。從而可以看出在乳腺發(fā)育、泌乳及退化的各個時期，瘦素的表達(dá)可正向誘導(dǎo)OB-Rb的表達(dá)。

2.2 奶牛乳腺中瘦素及其受體的表達(dá)定位

2.2.1 瘦素與β-catenin的表達(dá)定位

圖2為奶牛乳腺中瘦素的表達(dá)定位。由圖2可以看出，在青春期和妊娠早期，瘦素主要在乳腺脂肪細(xì)胞、大導(dǎo)管體細(xì)胞、帽細(xì)胞以及圍繞導(dǎo)管的基膜中被檢測到（圖3 A～C）。妊娠期，在脂肪細(xì)胞、導(dǎo)管上皮細(xì)胞和基膜中檢測到瘦素（圖3 D,E）。泌乳期瘦素存在于腺泡上皮細(xì)胞靠近基底側(cè)的部位以及細(xì)胞外基質(zhì)中（圖3 F～I(xiàn)）。在退化期，瘦素殘留在導(dǎo)管上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中（圖3 J,K）。

圖3中，紅色信號a是β-catenin；綠色信號b是leptin；藍(lán)色信號c是細(xì)胞核；L是陰性對照。下同。

2.2.2 瘦素受體OB-Rb與β-catenin的表達(dá)定位

圖3為奶牛乳腺中瘦素受體OB-Rb的表達(dá)定位。在青春期和妊娠早期，主要在乳腺脂肪細(xì)胞、大導(dǎo)管體細(xì)胞、帽細(xì)胞以及圍繞導(dǎo)管的基膜中檢測到OBRb（圖3 A～C）。妊娠晚期，在脂肪細(xì)胞和導(dǎo)管上皮細(xì)胞中檢測到OB-Rb（圖3 D和E）。泌乳期，OB-Rb存在于腺泡上皮細(xì)胞靠近基底側(cè)的細(xì)胞膜上（圖3 F～I(xiàn)）。在退化期，OB-Rb存在于殘留的導(dǎo)管上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中（圖3 J和K）。

3 討論

瘦素主要由脂肪細(xì)胞合成分泌，在奶牛乳腺組織中也同樣如此[6]。青春期乳腺組織中瘦素及其受體的表達(dá)水平相對較高，這是由于青春期乳腺組織實(shí)體結(jié)構(gòu)少，乳腺大部分被脂肪墊占據(jù)。妊娠期乳腺結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大改變，妊娠60～180 d乳腺以指數(shù)速率增加，分支小導(dǎo)管變長或變寬，脂肪組織迅速退化，乳腺中瘦素及其受體的表達(dá)量下降[7]。由于妊娠期缺少泌乳激素的作用，瘦素及其受體的表達(dá)量略有回升。這與Bonnet等運(yùn)用免疫熒光技術(shù)對綿羊妊娠期乳腺中瘦素的定位研究結(jié)果相似[8]。泌乳期由于催乳素大量表達(dá)，瘦素及其受體的表達(dá)量維持在低水平。幼仔離乳后，乳腺退化在12 h內(nèi)啟動，隨著乳腺實(shí)體組織的瓦解，乳腺脂肪墊重新生成，因此在退化階段乳腺組織中瘦素及其受體的表達(dá)逐漸增加，到退化30 d已經(jīng)恢復(fù)到妊娠初期的水平[9]。

瘦素及其受體的激光共聚焦結(jié)果證明：牛乳腺組織中瘦素，與小鼠、大鼠、人類細(xì)胞內(nèi)一樣具有自分泌和旁分泌的功能[10-12]。青春期瘦素除了在脂肪細(xì)胞中合成和分泌[13]，在導(dǎo)管上皮細(xì)胞和基膜中也檢測到瘦素的存在。這是由于脂肪細(xì)胞能合成、分泌瘦素,瘦素反過來作用于下丘腦維持著體脂的穩(wěn)定性。妊娠期乳腺組織進(jìn)入主要的發(fā)育階段，乳腺結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大改變。乳腺導(dǎo)管出現(xiàn)大量分支同時產(chǎn)生大量乳腺腺泡。直到分娩并開始泌乳，乳腺發(fā)育達(dá)到最大程度。妊娠早期，乳腺發(fā)育緩慢，此時乳腺中瘦素的表達(dá)含量變化不大。在這一階段，瘦素主要在脂肪細(xì)胞和導(dǎo)管上皮細(xì)胞中被檢測到。在泌乳期，乳腺導(dǎo)管末端完全發(fā)育成功能性腺泡，并維持腺泡結(jié)構(gòu)和功能。乳腺腺泡由單層上皮細(xì)胞圍成的空腔組成，外周由網(wǎng)狀肌上皮細(xì)胞包圍，肌上皮細(xì)胞外被由結(jié)締組織組成的基膜圍繞。腺泡之間填充著由纖維原細(xì)胞、白細(xì)胞和其它結(jié)締組織細(xì)胞組成的基質(zhì)，并伴有血管穿過基質(zhì)間的空隙。此時瘦素主要在乳腺腺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)，說明乳腺上皮細(xì)胞可以合成和分泌瘦素[4]。在乳腺退化過程中，乳腺組織功能性結(jié)構(gòu)迅速消退，乳腺腺泡由于細(xì)胞凋亡的啟動而瓦解。此時瘦素主要在脂肪細(xì)胞和殘存的導(dǎo)管上皮細(xì)胞中被檢測到。

青春期，OB-Rb在脂肪細(xì)胞和導(dǎo)管上皮細(xì)胞中表達(dá)。Laud等[14]用RT-PCR方法證明，在妊娠和泌乳期綿羊乳腺中有長型和短型瘦素受體的表達(dá)，原位雜交結(jié)果顯示瘦素受體轉(zhuǎn)錄本在乳腺上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)。O'brien[15]研究結(jié)果表明乳腺上皮細(xì)胞是瘦素合成和分泌的部位。妊娠期，隨著導(dǎo)管的發(fā)育，乳腺脂肪墊逐漸退化，在妊娠60～120 d，OB-Rb在脂肪細(xì)胞和導(dǎo)管上皮細(xì)胞中被檢測到；妊娠180 d，乳腺脂肪墊消失，功能性腺泡形成，OB-Rb專一性地在腺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)。泌乳期，OB-Rb在腺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上被檢測到，但其表達(dá)水平很低。同時乳腺中瘦素的表達(dá)也很弱，表明在泌乳期瘦素的功能不是維持乳腺結(jié)構(gòu)、乳汁合成和分泌所必需的。退化期，OB-Rb在脂肪細(xì)胞和殘留的導(dǎo)管上皮細(xì)胞中表達(dá)。由于腺泡結(jié)構(gòu)的瓦解和乳腺脂肪墊的重新生成，乳腺中OB-Rb的表達(dá)回升。在這一階段，瘦素是啟動退化期乳腺細(xì)胞凋亡的主要細(xì)胞因子，退化期瘦素功能性受體的高表達(dá)也說明瘦素在泌乳結(jié)束后乳腺組織重建的過程中必不可少[5]。

4 結(jié)論

奶牛乳腺整個發(fā)育過程中瘦素和瘦素受體的表達(dá)，青春期最高，妊娠期下降，泌乳期維持在低水平，退化期顯著升高，在退化30 d恢復(fù)到妊娠初期水平。瘦素及其受體在乳腺不同時期細(xì)胞中分布變化表明，瘦素專一性誘導(dǎo)OB-Rb的表達(dá)，且通過與OB-Rb的結(jié)合調(diào)控乳腺的發(fā)育和生理功能。

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Expression and localization of leptin and its receptor in mammary gland of dairy cow

GUO Hong-bo,LIN Ye,LI Qing-zhang,BIAN Yan-jie,XIAO Yang
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The protein expression and localization of leptin and its long form receptor(OB-Rb)were detected by western blottig methord and a confocal laser scanning microscope.The results showed that leptin protein level was higher in virgin,the lowest in lactation.Then OB-Rb was higher in virgin and pregnancy,lower in lactation,and recovered to the original level in involution.

dairy cow;mammary gland;leptin;OB-Rb

TS252.1

A

1001-2230（2011）06-0008-04

2011-01-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30671538）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（CXT005-1-1/CXT005-1-2）。

郭洪波（1984-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯游锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

李慶章