翟 騰，王旭波，王 晶，高金寧，翟介明，張全啟＊＊

（1.中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東青島266003；2.萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東萊州261418）

半滑舌鰨雌性特異fosmid克隆的篩選及FISH定位＊

翟 騰1，王旭波1，王 晶1，高金寧1，翟介明2，張全啟1＊＊

（1.中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東青島266003；2.萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東萊州261418）

通過對半滑舌鰨雌魚fosmid文庫進行有序混合，成功構(gòu)建了兩步－三維PCR篩選體系，為后續(xù)的基因篩選奠定了基礎(chǔ)。通過對半滑舌鰨W染色體文庫序列進行引物設(shè)計，并分別在雌、雄魚基因組DNA中篩選，獲得1對雌魚特異性引物。使用該引物對fosmid文庫進行篩選，得到1個雌魚特異性克隆，并通過熒光原位雜交技術(shù)將克隆定位到了W性染色體上，證實了使用該體系進行文庫篩選的有效性以及雌魚引物的特異性，建立了半滑舌鰨遺傳性別的分子及細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定方法，為后續(xù)半滑舌鰨基因組及性染色體的研究奠定了基礎(chǔ)。

半滑舌鰨；fosmid文庫；超級池；熒光原位雜交

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）屬鰈形目（Pleuronectiformes），舌鰨科（Cynoglossidae），舌鰨屬（Cynoglossus），為近海冷溫底棲性魚類，因其營養(yǎng)豐富、味道鮮美、出肉率高等特性深受消費者喜愛［1］，并已實現(xiàn)工廠化全人工養(yǎng)殖。隨著基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的飛速發(fā)展，對于半滑舌鰨基因組的相關(guān)研究也逐漸深入，目前已經(jīng)利用各種載體構(gòu)建了半滑舌鰨的全基因組文庫，如Shao等［2］構(gòu)建了半滑舌鰨的BAC文庫，孫曉華等［3］構(gòu)建了雌魚fosmid基因組文庫并進行了序列分析等?；蚪M文庫的構(gòu)建可以極大方便基因、基因組、染色體組的研究工作。通過對文庫進行有序混合，構(gòu)建文庫兩步－三維PCR篩選系統(tǒng)，可以實現(xiàn)文庫的準(zhǔn)確高效篩選，對于物理作圖、圖位克隆、分子標(biāo)記發(fā)掘及染色體定位等工作有重要作用。

半滑舌鰨具有雌、雄個體差異巨大的特性，雌性個體生長速度比雄性快2～3倍，成熟雌魚全長可達(dá)雄魚的2倍以上，體質(zhì)量可達(dá)雄魚的10倍［4］。因此，通過對半滑舌鰨性別決定和性腺分化等進行研究，并開展全雌育種，可以極大地提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖效益。目前，關(guān)于半滑舌鰨性別決定的研究也取得一定進展，周麗青等通過染色體分析，查明了半滑舌鰨性別決定為ZW型，雌性個體有1個較大的W染色體［5］；鄧思平等［6］對性腺分化及溫度對性別決定的影響的研究，陳松林等［7］獲得了雌魚特異性AFLP分子標(biāo)記，本研究室的Wang等［8］對其W性染色體進行了顯微切割分離并構(gòu)建了W性染色體DNA文庫。

快速鑒定半滑舌鰨的遺傳性別是進行全雌育苗的重要任務(wù)之一，在過去研究中，通過染色體顯微切割技術(shù)，已構(gòu)建了半滑舌鰨W性染色體特異文庫，因此，從已有文庫序列中篩選獲得雌魚特異性引物是進行雌雄鑒別的1個可行方法。獲得的雌魚特異性引物可通過三維PCR文庫篩選系統(tǒng)定位到fosmid文庫中，然后利用染色體熒光原位雜交技術(shù)（Florescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）將文庫中的雌魚特異性DNA片段定位到半滑舌鰨的染色體上，從而有效、直觀地驗證所得到的雌魚引物的特異性。

本研究通過篩選半滑舌鰨W染色體文庫，獲得雌魚特異性引物，同時利用三維PCR篩選系統(tǒng)，在已構(gòu)建的fosmid文庫中篩選出含有雌性特異片段的陽性克隆，并通過熒光原位雜交將該克隆定位到半滑舌鰨的W染色體上，證實了文庫篩選的有效性、證明了所篩選W染色體引物的特異性，同時為半滑舌鰨遺傳性別的鑒定提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

建庫用實驗材料為已建成的fosmid文庫第1～200號板，共19 200個單克隆。

熒光原位雜交所需半滑舌鰨雌魚取自山東近海（36°26′N，121°21′E）。

1.2 試劑

LB液體培養(yǎng)基，氯霉素，甘油，20×SSC，10%硫酸葡聚糖，TWEEN20，RNase A，生物素－切口平移探針標(biāo)記試劑盒，Avidin－Fluorescein，PI。

1.3 方法

1.3.1 超級池的構(gòu)建及質(zhì)粒的提取 超級池的構(gòu)建方法具體參照Zhang等［9］的實施方案。選取fosmid文庫中的200個96孔板，以每20個板為1組構(gòu)建超級池，一共構(gòu)建10個超級池。每個超級池含菌1 920個，全部超級池共含菌19 200個。使用常規(guī)堿裂解法提取超級池及其二級池的質(zhì)粒DNA，超純水溶解后4℃保存。

1.3.2 半滑舌鰨雌魚特異性引物的篩選 本研究室已經(jīng)在前期的工作中建立了染色體的顯微切割技術(shù)，并利用切割獲得的半滑舌鰨W染色體的DNA，構(gòu)建了半滑舌鰨W染色體特異文庫，分析獲得了文庫部分克隆的序列［8］，從該文庫中選取240條W染色體序列，使用Primer Premier（version 5.0）軟件設(shè)計引物，共得到引物210對，由博尚公司進行引物序列合成。使用梯度PCR儀（Bio－Red）確定各對引物的最適退火溫度，然后分別以半滑舌鰨雌、雄魚基因組DNA為模板進行PCR篩選，PCR反應(yīng)程序為94℃30 s，最適退火溫度30 s，72℃30 s，共25個循環(huán)，以期獲得雌魚的特異性引物。

1.3.3 雌魚特異性引物在fosmid文庫中的定位 以10個超級池的fosmid質(zhì)粒為模板，利用篩選出的半滑舌鰨雌魚特異性引物對其進行PCR篩選，退火溫度、PCR條件均為各引物的最適條件。對有陽性反應(yīng)的超級池進行行池、列池、板池的2次篩選，從而確定該陽性克隆所在的位置。

1.3.4 陽性克隆的熒光原位雜交 陽性克隆的質(zhì)粒提取步驟同1.3.1，熒光原位雜交具體步驟參考Wang等［8］的方法。

2 結(jié)果

2.1 超級池的構(gòu)建

構(gòu)建得到10個超級池。每個超級池下含35個二級池，即：8個行池、7個列池及20個板池。整個文庫由10個超級池和350個二級池組成。

2.2 半滑舌鰨雌魚特異性引物的篩選

210對引物經(jīng)過PCR篩選后，得到1對雌魚特異性的引物WS01（F：ACCTGTCAACCAGCAAAT；R：ACAGTGAAACAGCAGGGA）。該引物擴增產(chǎn)物長度為239bp。將半滑舌鰨雌、雄各10尾分別提取肌肉DNA作為模板，利用該引物進行PCR擴增，結(jié)果如圖1所示，僅在雌魚中有擴增條帶，表明篩選出的引物是半滑舌鰨雌性特異引物，可以用來鑒別半滑舌鰨的遺傳性別。

圖1 W染色體特異性引物WS01在半滑舌鰨雌、雄個體中的擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of the female－specific primer（WS01）t in female（♀）and male（♂）genomic DNA.M：DL2000 ladder

2.3 fosmid陽性克隆的篩選

使用半滑舌鰨雌魚特異性引物對超級池進行PCR篩選，結(jié)果見圖2A，在10個超級池中第三超級池有陽性信號。對第三超級池（041－060號板）進行第2次篩選，結(jié)果見圖2B、C，可見在H行池、列池3－1、列池4－1及第41號板有陽性信號，而列池3－1與列池4－1的交集為列池1，表示該克隆位于第41號96孔板的H－1孔中。

圖2 WS01在10個超級池中的篩選結(jié)果Fig.2 Superpools’screening result with female－specific primer（WS01）

2.4 陽性克隆的熒光原位雜交結(jié)果

將篩選出的含有雌性特異片段的f克隆提取質(zhì)粒并做成探針，經(jīng)C0t－1 DNA封阻后，對半滑舌鰨雌魚染色體分裂相進行熒光原位雜交，結(jié)果見圖3。在觀察到的所有分裂相中均出現(xiàn)1個雜交信號，該信號位于W染色體的中部（箭頭所示）。

圖3 A041H1克隆在半滑舌鰨雌魚染色體上的定位Fig.3 FISH localization of female－specific fosmid clone A041H1 on metaphase chromosome of female C.semilaevis

3 討論

基因組研究特別是物理圖譜的構(gòu)建有3個決定性的環(huán)節(jié)：連鎖圖的精細(xì)度、基因組文庫的質(zhì)量和文庫的篩選效率和準(zhǔn)確性［10－11］，其中第3個因素是制約整個基因組研究效率的瓶頸，直接影響到后續(xù)研究的進展和可靠性［12－14］。文庫的篩選分為三維PCR篩選法和雜交篩選法。雜交法使用同位素進行探針標(biāo)記，敏感度高但受放射性危害和半衰期短等的限制［15］。PCR篩選法操作簡單，具有快速、經(jīng)濟、靈敏度高，建成超級池后工作量小等優(yōu)點，因此本實驗選用三維PCR篩選法對半滑舌鰨雌魚fosmid文庫進行篩選。在對雌魚特異性引物的文庫篩選中可以看出，在構(gòu)建超級池后，只需要2步共45個PCR反應(yīng)｛10（超級池數(shù)）＋8（行池數(shù)）＋7（列池數(shù)）＋20（板池數(shù)）＝45個PCR反應(yīng)｝，即可從19 200個克隆中準(zhǔn)確找到目的克隆，可見此三維PCR篩選法效率之高。三維PCR篩選不僅可以迅速有效的篩選到大量功能基因用于基因組研究，還可以結(jié)合fosmid質(zhì)粒末端測序、FISH、染色體步移等技術(shù)構(gòu)建重疊群contigs，并將相關(guān)基因定位到染色體上，同時還對物理圖譜的構(gòu)建以及基因在圖譜上的定位有著重要的貢獻(xiàn)。

半滑舌鰨雌魚特異性引物的獲得對于進一步開展其性別決定機制研究具有重要意義，同時，對開展全雌品種培育也具有重要意義。半滑舌鰨的性別為ZW型決定方式［5］，且雌、雄個體差異非常大，雌性個體生長速度是雄性的2～3倍，成熟雌魚全長可達(dá)雄魚的2倍以上，體質(zhì)量可達(dá)雄魚的10倍，如此大的兩性差異在其他魚類中少有［4］。目前半滑舌鰨已實現(xiàn)工廠化全人工養(yǎng)殖。因此如何快速確定及選育半滑舌鰨雌魚成為大規(guī)模養(yǎng)殖中創(chuàng)造效益的關(guān)鍵，全雌育苗也成為半滑舌鰨養(yǎng)殖中的重大技術(shù)課題。實現(xiàn)全雌育苗的重要途經(jīng)之一是通過偽雄（生理上為雄性但遺傳上為雌性）與正常雌魚交配獲得超雌個體，然后由超雌個體培育全雌后代，而偽雄魚則可通過人工誘導(dǎo)雌魚性逆轉(zhuǎn)獲得，因此，如何從雄魚群體中識別偽雄魚個體，或者說如何簡單地區(qū)別遺傳上的雌魚和雄魚，是開展全雌育種的關(guān)鍵之一。不難看出，在篩選到半滑舌鰨雌性特異引物后，只需1次PCR反應(yīng)即可方便的鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，可用于篩選半滑舌鰨偽雄魚，同時對于偽雄與雌魚交配后代的檢驗也能起到重要的作用，從而促進半滑舌鰨全雌育種的發(fā)展。同時，通過對fosmid文庫進行三維PCR篩選得到的半滑舌鰨W染色體特異性的陽性克隆的方法，為半滑舌鰨性染色體基因組研究、性別相關(guān)的基因研究、性染色體的進化等提供了重要的方法參考。

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Screening and FISH Locating of a Female－Specific Fosmid Clone of Half－Smooth Tongue Sole

ZHAI Teng1，WANG Xu－Bo1，WANG Jing1，Gao Jin－Ning1，ZHAI Jie－Ming2，ZHANG Quan－Qi1
（1.The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Mingbo Aquatic.Com，Laizhou 261418，China）

A 2－step－3D－PCR screening system of the female half－smooth tongue sole fosmid library was successfully constructed by a orderly mixing of the fosmid clones.By priming and screening W－chromosome library of half－smooth tongue sole，one pair of female－specific primers were obtained.Using the female－specific primers，a W－chromosome DNA fragment was located in the fosmid library and assigned to W－chromosome using florescence in situ hybridization（FISH），which proved the exclusivity of the primers and provided a conformation on the efficiency of the 2－step－3D－PCR screening system.The female－specific primers could be of good use in pseudo－male detection of half－smooth tongue sole.This study provides a base for further genetic analysis in this species and will be important for a better understanding of the C.semilaevis W chromosome.

half－smooth tongue sole；fosmid library；super pool；florescence in situ hybridization

Q959.486

A

1672－5174（2011）11－057－04

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2006AA10A404）；山東省泰山學(xué)者建設(shè)工程專項資助

2011－04－08；

2011－05－16

翟 騰（1985－），男，碩士生，從事魚類遺傳育種研究。E－mail：cr－sh123＠163.com

＊＊通訊作者：E－mail：qzhang＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象