楊 宇，汪學軍，韋傳寶，2，余茂耘，吳琪瑤

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實訓中心，安徽六安237012；3.安徽大學生命科學學院，安徽合肥 230039）

皖貝母內(nèi)生真菌的初步研究

楊 宇1，汪學軍1，韋傳寶1，2，余茂耘1，吳琪瑤3

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實訓中心，安徽六安237012；3.安徽大學生命科學學院，安徽合肥 230039）

采用平板分離法從皖貝母新鮮鱗莖、莖桿和葉中分離出2種內(nèi)生真菌（A1和B1），通過菌落形態(tài)和ITS序列確定內(nèi)生菌的種屬，通過DNAMAN軟件多重序列比對確定與其他真菌的同源關(guān)系。結(jié)果表明，A1歸為被孢霉屬，與Mortierella elongata的ITS序列同源性高達99.44%；另一種歸為青霉屬，與Penicillium janthinellum的ITS序列同源性高達98.65%。

皖貝母；內(nèi)生真菌

內(nèi)生菌（endophyte）是指在其生活史的某一階段或整個時期生活于植物組織器官內(nèi)部，而不引起被浸染的宿主植物發(fā)生明顯性狀改變的菌類，主要包括真菌、放線菌和細菌。研究表明，某些內(nèi)生菌能夠促進植物次生代謝產(chǎn)物的合成，并且具有與宿主植物相似的代謝途徑，產(chǎn)生相同的活性次生代謝產(chǎn)物［1］。因此，植物內(nèi)生菌作為新的微生物資源受到廣泛關(guān)注。

皖貝母（Fritillaria anthuiensis S.C.Chen et S.F.Yin）屬于百合科（Liliaceae）貝母屬（Fritillaria L.）藥用植物［2］，在安徽省種植較多，是安徽省名貴中藥材［3］，可用于治療急、慢性支氣管炎等疾病［4］。目前，對貝母屬植物內(nèi)生菌的研究很少，國內(nèi)僅葉波平等從浙貝母［5］、祝興偉等從伊犁貝母［6］中分離出內(nèi)生真菌。本文以皖貝母新鮮鱗莖、莖桿和葉為材料，分離其內(nèi)生菌，通過測定其ITS序列鑒定其種屬，通過DNAMAN軟件多重序列比對確定與其他真菌的同源關(guān)系，為研究皖貝母內(nèi)生菌奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從安徽省霍山縣采集健康的皖貝母鱗莖備用。

1.2 方法

1.2.1 皖貝母內(nèi)生真菌的分離與保藏

在無菌條件下將皖貝母鱗莖表面清洗干凈，晾干后用75%酒精浸泡1.5min，無菌水沖洗1次，10%次氯酸鈉溶液浸泡5min，無菌水沖洗1次，再用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗干凈。將鱗莖切割成0.5× 0.5cm2的塊狀，截面向下置于含青霉素的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000ml，pH自然），最后一次沖洗液作為對照。28℃條件下培養(yǎng)，觀察期間菌落形態(tài)、顏色等特征，將形態(tài)、顏色不同的菌落轉(zhuǎn)接到新的固態(tài)培養(yǎng)基上，編號，28℃培養(yǎng)3～7d，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 皖貝母內(nèi)生真菌的形態(tài)學觀察及初步分類

觀察并記錄各菌落的形態(tài)。參照沈萍等透明膠帶法［7］（P74）制作臨時裝片，用低倍鏡、高倍鏡進行鏡檢，并置于油鏡下觀察、拍照保存。

1.2.3 皖貝母內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定

選擇不同形態(tài)的真菌進行ITS序列測序，每種真菌獨立測定3株，由上海生工生物工程有限公司完成。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行Blast分析，結(jié)合形態(tài)學特征確定內(nèi)生菌的種屬；通過DNAMAN軟件將ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣種序列進行多重序列比對，用DNAMAN軟件中Observe Divergency方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 皖貝母內(nèi)生真菌的分離與保藏

從皖貝母鱗莖、莖桿和葉中共發(fā)現(xiàn)2種不同形態(tài)的真菌，分別標號A、B，每種選擇3株保存，分別標號A1、A2、A3、B1、B2和B3。

2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)學觀察

A1、A2和A3形態(tài)一致，毛氈狀，表面灰綠色，附著絮狀絨毛，背面暗黃色，孢子為孢囊孢子，孢囊梗呈伸長絲狀，幾乎不分枝，孢子囊頂生球形，以A1作為代表，形態(tài)見圖1。B1、B2和B3形態(tài)一致，白色，毛氈狀，有輻射狀褶皺，附著絮狀絨毛，背面略呈橘黃色，孢子為分生孢子，孢子梗分生呈掃帚狀，孢子球形串生，以B1作為代表，形態(tài)見圖2。

圖1 A1孢囊孢子、孢囊及孢囊梗

圖2 B1分生孢子及孢子梗

2.3 內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定

測序結(jié)果顯示A1、A2和A3序列相同，以A1作為代表；B1、B2和B3序列相同，以B1作為代表。序列經(jīng)同源序列比對，發(fā)現(xiàn)與A1的ITS序列同源性最高的4株為Mortierella屬；與B1的ITS序列同源性最高的4株為Penicillium屬。使用DNAMAN軟件中Observe Divergency方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：A1的ITS序列與GenBank中12個近緣種（表1）序列同源性為65.67%～99.44%，其中Mortierella elongata與A1的ITS序列同源性高達99.44%，Mortierella indohii與A1的ITS序列同源性最低，為65.67%（圖3）。B1的ITS序列與GenBank中17個近緣種（表2）序列同源性為80.36%～98.65%，其中Penicillium janthinellum與B1的ITS序列同源性高達98.65%，Penicillium purpurogenum與B1的ITS序列同源性最低，為80.36%（圖4）。

表1 A1與12個近緣種Genbank登錄號及拉丁名

表2 B1與17個近緣種Genbank登錄號及拉丁名

圖3 A1的ITS序列與GenBank中12個近緣種序列同源進化分析

圖4 B1的ITS序列與GenBank中17個近緣種序列同源進化分析

3 討論

從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，貝母類植物內(nèi)生菌種類較多，而且分屬于不同的科屬。祝興偉等人從伊犁貝母中分離的內(nèi)生菌尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum Y1屬于鐮刀霉屬［6］；葉波平等人從浙貝母中分離的內(nèi)生菌Nectria sp.JZ6屬于叢赤殼屬［5］；本文從皖貝母中分離的內(nèi)生菌長被孢霉屬于被孢酶科，被孢霉屬成員；而另一種內(nèi)生菌微紫青霉屬于曲霉科，青霉屬成員。長被孢霉因其含有豐富的γ－亞麻酸（GLA）、花生四烯酸（ARA）［8］，二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），廣泛被研究用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，東京大學農(nóng)化系已從長被孢霉IS－4獲得了500mg／L EPA的產(chǎn)量［9］；微紫青霉對重金屬離子有較強的吸附能力，可用于重金屬污水的處理［10］［11］；本文分離的長被孢霉和微紫青霉是否有這些功能尚待進一步研究。

［1］Stierle A，Strobel G，Stierle D.Taxol and Taxane Production by Tanomyces Andreanea，an Endophytic Fungus of Pacific Yew［J］.Science，1993，260：214－216.

［2］殷淑芬.安徽貝母屬新植物［J］.植物分類學報，1983，21（1）：100.

［3］謝中穩(wěn)，張智.安徽貝母種子資源及其利用［J］.植物學通報，1994，（2）：56－57.

［4］李成網(wǎng)，李清華.薄層掃描法測定皖貝精膠囊貝母素甲的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2001，7（3）：21－22.

［5］葉波平，張少華，劉冰，等.浙貝母內(nèi)生真菌Nectria sp.JZ6分泌抑菌活性代謝產(chǎn)物的初步研究［J］.菌物學報，2009，28（4）：603－609.

［6］祝興偉，張少華，王治維，等.一株來自于伊犁貝母的內(nèi)生尖孢鐮孢菌Y1的抑菌活性初步研究［J］.菌物學報，2009，28（3）：349－353.

［7］沈萍，陳向東.微生物學實驗［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［8］雷幫星，梁宗琦，劉作易，等.利用真菌生產(chǎn)GLA、Ara和EPA的研究進展［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學報，2000，19（5）：388－393.

［9］魏明，曹健.利用微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究進展［J］.鄭州工程學院學報，2002，23（3）：90－94.

［10］黃曉婷，梁鈺，秦會娟，等.預處理方式對微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR吸附Zn2＋影響的研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2008，27（4）：405－411.

［11］周媛，黃曉婷，黃桂海，等.微紫青霉菌菌株GXCR對低品位黃銅礦中的Cu和Fe的生物淋濾及其淋濾機制［J］.生物工程學報，2008，24（2）：1993－2002.

A Preliminary Study on Endophytic Fungi from Fritilaria anhuiensis

YANG Yu1，WANG Xue－jun1，WEI Chuan－bao1，2，YU Mao－yun1，WU Qi－yao3

（1.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEengineering，WesternAnhuiUniversity，Lu’an237012，China；2.AnhuiProvincePlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012，China；3.CollegeofLifeScience，AnhuiUniversity，Hefei230039，China）

Two kinds of endophytic fungi（named A1and B1）were separated from fresh Fritilaria anhuiensis bulb，stem and leaf by culture dish.Their taxonomy were determined by morphology analysis and ITS analysis.The relationship with other fungi were determined by DNAMAN analysis.The results indicated that A1belongs to genus Mortierella and shared 99.44%nucleotide acid identities with Mortierella elongata ITS.B1belongs to genus Penicillium and shared 98.65%nucleotide acid identities with Penicillium janthinellum ITS.

Fritilaria anhuiensis；endophytic fungi

Q939.95

A

1009－9735（2011）05－0008－03

2011－10－01

安徽省教育廳自然科學基金重點項目資助（KJ2010A328，KJ2011A272）。

楊宇（1989－），男，安徽安慶人，研究方向：分子生物學。

韋傳寶（1961－），男，安徽壽縣人，副教授，博士，碩士生導師，研究方向：植物病毒。