楊 婧 張海風(fēng) 王 媛 趙 勤 張新勝 單 杰

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,河南 鄭州 450001)

癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的一大重要疾病,目前通常采用化療、放療、手術(shù)切除等方法進(jìn)行癌癥的治療。但是癌癥的治療一般都很困難,并且預(yù)后不佳〔1〕。血色素氧化酶-1(HO-1)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在的一種可誘導(dǎo)酶,它是血色素在機(jī)體內(nèi)被降解過程中的限速酶〔2〕,具有抗氧化,抗凋亡等效應(yīng),是細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)酶類,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大關(guān)系。有研究表明在大部分癌癥組織里,HO-1蛋白表達(dá)變得很高〔3〕,同時(shí)機(jī)體內(nèi)對(duì)抗外界氧化作用的其他酶如超氧化物歧化酶(SOD)、超氧化氫酶 (CAT)等的表達(dá)和活效都有或高或低的下降〔4,5〕。這說明 HO-1在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到了保護(hù)癌細(xì)胞的作用。Tet-off調(diào)控系統(tǒng)具有效能高、毒副作用小,并有嚴(yán)謹(jǐn)“開關(guān)”功能的優(yōu)點(diǎn),能夠表達(dá)連接在其上的目的基因?？赏ㄟ^四環(huán)素類和鹽酸多西環(huán)素〔強(qiáng)力霉素類 (Dox)〕藥物對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)。前期的研究中構(gòu)建 HO-1的真核表達(dá)載體,但該表達(dá)載體并不能人為地有效調(diào)控目的基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用 Tet-off調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)載體,構(gòu)建一個(gè)能夠人為調(diào)控目的基因 HO-1表達(dá)的真核表達(dá)載體 pB I-EGFP-hHO-1,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性核酸內(nèi)切酶 NheⅠ、MluⅠ(Freg Ments公司產(chǎn)品);限制性核酸內(nèi)切酶 HindⅢ、BamHⅠ、Marker DL2000、10×Loading buffer、T4 DNA連接酶、核酸膠回收試劑盒 (TaKa-Ra公司產(chǎn)品);質(zhì)粒小量提取試劑盒 (AxyPrep公司產(chǎn)品);Taq DNA聚合酶、dNTP、lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、TR IZOL Reagent(Invitrogen公司產(chǎn)品);RPM I1640培養(yǎng)粉 (G IBCO公司產(chǎn)品);胰蛋白酶 (Sigma公司產(chǎn)品);小牛血清 (杭州四季青公司);cDNA第一鏈合成試劑盒 (B IORED公司產(chǎn)品);兔抗人HO-1多克隆抗體、兔抗人β-Actin抗體 (SANTA CRUZ產(chǎn)品);S-P免疫組化試劑盒 (中杉金橋生物工程公司);鹽酸多西環(huán)素(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司);質(zhì)粒 pcDNA3.1-hHO-1、質(zhì)粒pB I-EGFP、質(zhì) 粒 pTet-off(由 本 室 保 存);細(xì) 菌 菌 株(E.Coli.DH5α)(由本室保存 );人肝癌 (S MMC7721)細(xì)胞系(由本室保存)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1的構(gòu)建 將本室保存的含有質(zhì)粒 pcDNA3.1-hHO-1的 E.Coli.DH5α劃板過夜,挑取單個(gè)菌落于 50 mlLB培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒,用 HindⅢ和 BamHⅠ雙酶切得到 HO-1小片段,電泳鑒定為約 800 bp。之后取上述 pcDNA3.1-hHO-1質(zhì)粒作為 PCR擴(kuò)增模板,在引物中添加 NheⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)擴(kuò)增 HO-1片段,電泳后回收。用NheⅠ和 MluⅠ雙酶切 37℃分別處理回收的片段和質(zhì)粒 pB IEGFP,瓊脂糖凝膠電泳后分別膠回收 pB I-EGFP大片段和HO-1小片段。純化后將片段在 T4連接酶作用下進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。提取重組質(zhì)粒后用 NheⅠ/MluⅠ雙酶切鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細(xì)胞 S MMC-7721中的表達(dá)

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用含 10%小牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)基,將肝癌 S MMC-7721細(xì)胞在 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以適當(dāng)密度接種在 25 ml培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后密度達(dá)到 90%～95%時(shí),使用 lipofectamine2000脂質(zhì)體按照說明書將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)轉(zhuǎn)染組。

1.2.2.2 RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1表達(dá) 以適當(dāng)密度接種在 25 ml培養(yǎng)瓶中,分為三組：①陽(yáng)性對(duì)照即未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組。②轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒 pB I-EGFP、Tet-off組。③轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off組。轉(zhuǎn)染后 48 h分別提取細(xì)胞總RNA。使用B IORED公司 cDNA第一鏈合成試劑盒合成 cDNA第一鏈。取上述產(chǎn)物 2μl作為 PCR擴(kuò)增模板,設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增 HO-1基因序列中約 110 bp特異片段,同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參對(duì)照β-actin片段,2%瓊脂糖凝膠電泳,分析 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。1.2.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表達(dá) 細(xì)胞以適當(dāng)密度接種在 25 ml培養(yǎng)瓶中,分為四組①未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組,②轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off組。①、②組又分別設(shè)立其陰性對(duì)照組①-a、②-a(即由 PBS取代第一抗體)。待轉(zhuǎn)染 48 h后,做免疫細(xì)胞化學(xué)。光電顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果。

1.2.3 不同濃度鹽酸多西環(huán)素誘導(dǎo) Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1在細(xì)胞中的表達(dá) 待細(xì)胞貼壁,密度達(dá)到 90%～95%,將25 ml培養(yǎng)瓶中細(xì)胞分別標(biāo)記為 1～9號(hào),將 Tet-off和 pB I-EGFP-hHO-1共轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌 S MMC-7721細(xì)胞,24 h后分別加入不同濃度的鹽酸多西環(huán)素溶液 ,依次為：1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml。48 h后分別提取細(xì)胞總 RNA,同時(shí)提取 1瓶未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作 RT-PCR,2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1的構(gòu)建 NheⅠ/MluⅠ雙酶切重組質(zhì)粒后電泳可見約 5 100 bp及約 866 bp條帶,與質(zhì)粒 pB IEGFP及 HO-1基因序列長(zhǎng)度相一致。說明已將質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 重組載體質(zhì)粒 pBI-EGFP-hHO-1酶切鑒定結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細(xì)胞 S MMC-7721中的表達(dá)

2.2.1 RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1表達(dá) 以βactin mRNA的表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照,檢測(cè)三組 HO-1的 mRNA的表達(dá)：①未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對(duì)照組;②轉(zhuǎn)染 pB I-EGFP、Tet-off空質(zhì)粒組;③轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off組。結(jié)果顯示：以內(nèi)參引物為引物經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增后可見約 427 bp電泳條帶,半定量分析三組細(xì)胞中β-actin mRNA表達(dá)在凝膠電泳圖條帶亮度上無顯著差異,這說明三組細(xì)胞提取的總 RNA量相等。以特異性引物經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增后見到約 110 bp電泳條帶,且③組的 HO-1特異片段的mRNA比①、②組明顯增高。可判斷四環(huán)素調(diào)控 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off系統(tǒng)在肝癌細(xì)胞 S MMC7721中 HO-1 mRNA的表達(dá)增高。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測(cè) HO-1基因 mRNA在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)

2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表達(dá) ①-a、②-a細(xì)胞上未見棕紅色染色。①、②組細(xì)胞均有紅棕色,且②組中一部分細(xì)胞紅棕色染色明顯深于①組。說明 Tet-Off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌細(xì)胞 S MMC7721中 HO-1蛋白質(zhì)的表達(dá)增高。見圖3。

2.3 不同濃度鹽酸多西環(huán)素誘導(dǎo) Tet-off調(diào)控的 pB I-EGFP-hHO-1在細(xì)胞中的表達(dá) 檢測(cè) 10組 HO-1mRNA的表達(dá)。①未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陰性對(duì)照組②-⑩分別為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off 24 h后加入 1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml鹽酸多西環(huán)素溶液組。結(jié)果顯示：當(dāng)鹽酸多西環(huán)素溶液濃度達(dá)到 2 000 ng/ml時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off組的 HO-1含量接近陰性對(duì)照組,即 Tet-off調(diào)控得 pB I-EGFP-hHO-1的鹽酸多西環(huán)素誘導(dǎo)濃度為 2 000 ng/ml。見圖4。

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) HO-1蛋白質(zhì)在 SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)

1～11：1,5,10,50,100,500,1 000,2 000,3 000 ng/ml多西環(huán)素組 ;未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組;Marker

3 討 論

HO-1在機(jī)體遭遇機(jī)體氧化或應(yīng)對(duì)外界刺激的時(shí)候保護(hù)細(xì)胞,但恰恰這種保護(hù)作用在化學(xué)藥物治療或射線放射治療癌癥時(shí),HO-1卻變成了癌細(xì)胞的保護(hù)酶,使療效降低甚至失去療效。當(dāng)腫瘤治療達(dá)到恢復(fù)階段時(shí),化學(xué)藥物治療和放射射線治療產(chǎn)生的氧化自由基會(huì)繼續(xù)作用于機(jī)體的正常健康細(xì)胞,如果這些氧化自由基不能及時(shí)清除,癌癥患者會(huì)恢復(fù)緩慢甚至誘發(fā)新的腫瘤,如果在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候能夠增強(qiáng) HO-1的表達(dá),就可以保護(hù)正常細(xì)胞。鑒于以上種種,本文試圖找到安全有效的方法來調(diào)控 HO-1的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)采用的 Tet-off系統(tǒng),是目前應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng),它具有在機(jī)體內(nèi)外都能進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的優(yōu)點(diǎn)〔6〕,可以用于原核生物體,真核生物體模型。其誘導(dǎo)物四環(huán)素類和強(qiáng)力霉素類價(jià)格低廉,毒性小,使其正逐漸成為一種較為理想的誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含調(diào)控質(zhì)粒和應(yīng)答質(zhì)粒,調(diào)控質(zhì)粒 Tet-off,質(zhì)粒中含有一個(gè)融合的轉(zhuǎn)錄活化因子結(jié)構(gòu) tTA,該因子由細(xì)菌的四環(huán)素阻遏物 TetR和人類單純皰疹病毒 (HSV)的 VP16轉(zhuǎn)錄激活蛋白融合而成〔7〕,進(jìn)一步修飾后能被四環(huán)素類及衍生物誘導(dǎo)并激活。應(yīng)答質(zhì)粒 pB I-EGFP,質(zhì)粒上含有一個(gè) Pbi-1的結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)包含 Tet反應(yīng)性元件 TRE(包含細(xì)菌四環(huán)素操縱子DNA序列 TetO)和人類巨噬細(xì)胞立早啟動(dòng)子 PminCMV-1和 PminCMV-2,PminCMV-1啟動(dòng)子后有多克隆位點(diǎn),可以插入外源目的基因,PminCMV-2接有 EGFP綠色熒光蛋白基因〔8〕。當(dāng)誘導(dǎo)因子 (四環(huán)素類衍生物)不存在時(shí),tTA中 TetR成分和 TetO序列結(jié)合,通過 VP16發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,啟動(dòng)目的基因及熒光蛋白基因轉(zhuǎn)錄。加入誘導(dǎo)因子后,誘導(dǎo)因子與 tTA結(jié)合使其從 TRE上脫落,終止目的基因和熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。從而實(shí)現(xiàn)在外源誘導(dǎo)因子的作用下認(rèn)為的控制目的基因的表達(dá)或關(guān)閉,并同時(shí)有綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因〔9〕。

有資料表明〔10〕,鹽酸多西環(huán)素的半衰期比四環(huán)素長(zhǎng),即相同劑量的鹽酸多西環(huán)素與四環(huán)素相比能夠在體內(nèi)存在更長(zhǎng)的時(shí)間,發(fā)揮藥效的時(shí)間更長(zhǎng),因此本實(shí)驗(yàn)中選取鹽酸多西環(huán)素作為誘導(dǎo)劑。

在本實(shí)驗(yàn)中 Tet-off作為調(diào)控質(zhì)粒,pB I-EGFP作為應(yīng)答載體,選用鹽酸多西環(huán)素作為誘導(dǎo)劑。采用定向克隆將 PCR擴(kuò)增的目的基因 HO-1片段插入到真核表達(dá)載體 pB I-EGFP中,將構(gòu)建好的 pB I-EGFP-hHO-1質(zhì)粒與調(diào)控質(zhì)粒 Tet-off雙轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞 S MMC-7721中,48 h后檢測(cè) HO-1在 mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。采用 RT-PCR方法檢測(cè)加入不同濃度的鹽酸多西環(huán)素后,重組質(zhì)粒中 HO-1的表達(dá),得到 Tet-off調(diào)控的 pB IEGFP-hHO-1的鹽酸多西環(huán)素誘導(dǎo)濃度為 2 000 ng/ml。載體構(gòu)建成功,以及鹽酸多西環(huán)素對(duì)該 Tet-off調(diào)控系統(tǒng)誘導(dǎo)濃度的確定,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 Motterlini R,Foresti R,Bassi R,et al.Endothelial heme oxygennase-1 induction by hypoxia〔J〕.J Biol Chem,2007;275(18)：13613-20.

2 陸獻(xiàn)成,劉志勇 .血紅素加氧酶-1的研究及應(yīng)用進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)學(xué) ,2007;35(1)：72-5.

3 Eefrsw D,Rfrwae P,SouyteD,et al.Chronic treatment with sulfhy dry angiotensin converting enzyme inhibitors reduce susceptibility of plasma LDL to in vitro oxidation formation of oxidation specific epitopes in the arterialwall and atherogenesis in apolipoprotein E knockoutmice〔J〕.Int J,2006;81(1)：107-15.

4 MesriM,Morales-Ruiz M,Ackermann EJ,et al.Suppression of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by survivin targeting〔J〕.Am J Pathol,2005;158(5)：1757-65.

5 Sugawara Y,Makuuchi M.Small-for-size graft problems in adult-to-adult living-donor liver transplantation〔J〕.Transplantation,2008;75(3)：20-2.

6 Aoessen M,Buerted H.Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2007;89(2)：5547-51.

7 Perl AK,Tichelaar JW,Whitsett JA.Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse〔J〕.Transgenic Res,2002;11(1)：21-9.

8 楊麗華,周常文 .四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2009;17(2)：3-5.

9 Lamartina S,Roscilli G,Rinaud CD,et al.Stringent control of gene expression in vivo by using novel doxycycline-dependent trans-activators〔J〕.Hum Gene Ther,2002;13(2)：199-210.

10 Shaikh S,Souise F,Nicholson LF.Optimization of the tet-on system for inducible expression of RAGE〔J〕.J Biomol Tech,2006;17(4)：283-92.