王 俊 祁 偉 吳 瑾 王淑香 郭文學 馬艷紅

天津地區(qū)志賀菌耐藥性及整合子攜帶調(diào)查

王 俊 祁 偉△吳 瑾 王淑香 郭文學 馬艷紅

目的：了解天津地區(qū)志賀菌抗生素耐藥性變遷及1、2類整合子攜帶狀況。方法：K-B紙片法測定1981—1983年及2009年天津地區(qū)臨床分離的57株志賀菌藥敏情況。以煮沸法制備細菌總DNA作為PCR擴增模板。PCR方法擴增1、2類整合子整合酶及可變區(qū)并測序分析。PCR產(chǎn)物直接測序，結果經(jīng)BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫標準菌株比對分析。結果：1981—1983年組志賀菌對四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素及復方新諾明敏感率低，3種及3種以上抗生素多重耐藥率為66.67%；2009年組志賀菌對氨芐西林、鏈霉素、復方新諾明、哌拉西林和四環(huán)素敏感率低，3種及3種以上抗生素多重耐藥率為83.33%。1981—1983年組1類整合子陽性率為87.88%（29/33），27株可變區(qū)含氨基糖苷類藥物耐藥基因aadA；1株宋內(nèi)志賀菌可變區(qū)含甲氧芐啶耐藥基因dfrA17和氨基糖苷類藥物耐藥基因aadA5；未發(fā)現(xiàn)2類整合子陽性株；2009年組1類整合酶陽性率為79.17%（19/24），可變區(qū)及末端擴增均陰性；2類整合子陽性率87.50%（21/24），可變區(qū)含dfrA1+sat1+aadA1，介導甲氧芐啶、鏈絲菌素和鏈霉素耐藥;其中17株1、2類整合酶均陽性。結論：2009年分離的志賀菌抗生素耐藥較上世紀80年代分離的志賀菌增強，多重耐藥菌株增加。天津地區(qū)志賀菌攜帶1、2類整合子。

志賀菌屬 整合子類 藥物耐受性 紙片擴散抗菌試驗 聚合酶鏈反應 天津

志賀菌屬是導致人類細菌性腹瀉的常見致病菌之一。20世紀80年代以來，隨著廣譜抗生素的廣泛使用，耐藥志賀菌逐漸增多。文獻報道，1、2類整合子與志賀菌耐藥相關[1]。本文研究了志賀菌對15種抗生素的耐藥性及1、2類整合子的攜帶情況，旨在了解本地區(qū)志賀菌耐藥性變遷和1、2類整合子攜帶情況。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 實驗菌株為分離自天津市多家三級甲等醫(yī)院腸道門診患者（2~76歲）糞便標本的志賀菌株共57株，其中1981—1983年分離33株，由本研究所保存；2009年6月—10月分離24株。所有菌株均經(jīng)常規(guī)鑒定證實。

1.2 試劑 藥敏紙片為復方新諾明、諾氟沙星、左氧氟沙星、氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星，共15種，購自北京天壇生物制品研究所。引物合成由上海生工生物技術有限公司完成，PCR產(chǎn)物測序由北京六合華大基因技術有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 藥物敏感試驗 抗生素敏感性試驗依據(jù)CLSI2009年推薦標準，采用K-B紙片法進行檢測。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.2 細菌總DNA的提取 以煮沸法[2]制備細菌總DNA作為PCR擴增模板。

1.3.3 整合子的檢測與分析 引物intI1L/intI1R[2]、qacE△1F/sul1B[3]、intI2L/intI2R[2]分別擴增1類整合子整合酶保守末端及2類整合子整合酶，引物hep58/hep59[4]、hep74/hep51[5]分別擴增1、2類整合子可變區(qū)，見表1。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布序列自行設計下游引物dfrA12R、dfrA17R、aadAR、aadA5R，以hep58為上游引物擴增相應耐藥基因盒；取PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。PCR產(chǎn)物直接測序，結果經(jīng)BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫標準菌株比對分析。

表1PCR擴增反應引物

1.3.4 限制性內(nèi)切酶反應 取PCR擴增產(chǎn)物10 μL加內(nèi)切酶緩沖液1.5 μL，酶Hinf I1 μL，37 ℃孵育2 h；將酶切產(chǎn)物8 μL加上樣緩沖液1 μL，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，F(xiàn)isher確切概率法進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥敏實驗結果 1981—1983年組志賀菌對四環(huán)素敏感率最低，其次是鏈霉素、氯霉素、復方新諾明，對3種及3種以上抗生素耐藥多重耐藥菌株占全部菌株的66.67%（22/33），對氨芐西林等敏感率均大于80%；而2009年組志賀菌對氨芐西林敏感率最低，其次是鏈霉素、復方新諾明、哌拉西林和四環(huán)素，3種及3種以上抗生素多重耐藥菌株為83.33%（20/24）。對氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢曲松、復方新諾明敏感率2009年組較1981—1983年組下降，而四環(huán)素及氯霉素敏感率則升高。志賀菌對三代頭孢菌素及氟喹諾酮類藥物敏感率高，未發(fā)現(xiàn)亞胺培南耐藥株，見表2。

2.2 1類整合子檢測結果 1981—1983年組1類整合子陽性率為87.88%（29/33），其中福氏志賀菌87.5%（28/32），29株1類整合酶陽性株末端擴增均陽性。28株整合子可變區(qū)陽性，其中27株擴增產(chǎn)物大小相同，酶切分析證實為同一片段，大小約為1 000 bp，測序顯示含氨基糖苷類藥物耐藥基因盒aadA；另1株宋內(nèi)志賀菌可變區(qū)大小約1 700 bp，含甲氧芐啶耐藥基因dfrA17和氨基糖苷類藥物耐藥基因aadA5，見圖1。2009年組陽性率為79.17%（19/24），其中福氏志賀菌12株，宋內(nèi)志賀菌6株，鮑氏志賀1株。19株1類整合酶陽性，但1類整合子可變區(qū)及末端擴增均陰性，見表3。2009年組志賀菌基因盒擴增顯示6株blaoxa-30和aadA1陽性,7株dfrA12擴增陽性，經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析（BLAST）結果為99%；dfrA17及aadA5擴增陰性。

2.3 2類整合子檢測結果 1981—1983年組33株中均陰性。2009年組24株志賀菌中21株（87.50%）2類整合酶擴增陽性，其中福氏志賀菌11株，宋內(nèi)志賀菌為9株,鮑氏志賀菌為1株；其中1、2類整合酶均陽性17株。21株2類整合子可變區(qū)陽性產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hinf I酶切分析，帶型一致，為同一片段，見圖2。選取1例2類整合子擴增陽性的標本測序，發(fā)現(xiàn)2類整合子大小約為2 200 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，含有甲氧芐啶耐藥基因dfrA1、鏈絲菌素耐藥基因sat1和鏈霉素耐藥基因aa?dA1，同源性達99%。

表2 57株志賀菌藥敏結果

表3 1、2類整合子檢測結果

3 討論

在我國，由志賀菌引起的細菌性痢疾的發(fā)病率仍較高，其中以福氏志賀菌為主，但宋內(nèi)志賀菌所占比例有上升趨勢。天津地區(qū)細菌性痢疾現(xiàn)今流行的菌型以福氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌為主，與上海地區(qū)報道相似[6]。

本研究藥敏結果顯示，志賀菌對氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松、復方新諾明耐藥率明顯上升，而四環(huán)素及氯霉素耐藥率較前明顯下降，且有統(tǒng)計學意義，考慮與臨床應用頻度及抗生素的選擇有關。2009年組志賀菌對氯霉素耐藥率與上海地區(qū)的調(diào)查結果相似[6]，但與江蘇淮安的調(diào)查結果[7]（80%左右）相比有很大不同，可見志賀菌對氯霉素的耐藥率表現(xiàn)出明顯的時間性差異及地域性差異。本實驗結果還顯示天津地區(qū)2009年組志賀菌對3種及3種以上抗生素耐藥的多重耐藥菌株較1981—1983年組明顯增加。

整合子是1989年由Stokes等[8]首次提出的，整合子的基本結構由保守末端（5conserved segment，CS）、保守末端（conserved segment，CS）和兩者之間的可變區(qū)（variable region）組成。CS是整合子的基本結構，包括編碼整合酶（integrase，IntI）的基因（intI）、整合子重組位點attI和整合子可變區(qū)啟動子（Pant）?？勺儏^(qū)帶有不同數(shù)量和功能的基因盒，但可變區(qū)并不是整合子的基本結構，有的整合子在CS和CS之間沒有基因盒插入。整合子在整合酶的作用下能識別并俘獲或刪除移動性基因盒，并在位于整合子上游的啟動子的作用下得到表達，使細菌具有耐藥及多重耐藥性。

本研究顯示天津地區(qū)志賀菌1類整合酶陽性率1981—1983年組為87.88%，其中福氏志賀菌87.5%，2009年組為79.17%，其中福氏志賀菌為92.31%（12/13）。擴增1類整合子可變區(qū)發(fā)現(xiàn)，1981—1983年組28株可變區(qū)陽性，其CS也均為陽性，但是2009年組19株1類整合酶陽性，可變區(qū)及CS均為陰性，為除外CS變異造成漏檢,本研究中根據(jù)1類整合子中通常攜帶的耐藥基因盒dfrA12、dfrA17、aadA及aadA5基因序列，自行設計下游引物dfrA12R、dfrA17R、aadAR、aadA5R，以hep58為上游引物，擴增相應耐藥基因盒，以便進一步確認是否存在可變區(qū)，結果顯示7株dfrA12擴增陽性；6株aadA擴增陽性，并在其上游包含blaoxa-30基因，表明在這些菌株中，1類整合子CS缺失或存在變異。2類整合酶擴增結果顯示1981—1983年組33株志賀菌均為陰性，2009年組陽性率為87.5%。Mammina等[9]研究發(fā)現(xiàn)意大利南部宋內(nèi)志賀菌中2類整合子陽性至少要追溯到上世紀80年代。本研究2類整合酶陽性菌株可變區(qū)擴增均陽性，經(jīng)酶切分析證實為同一片段，序列比對顯示2類整合子攜帶甲氧芐啶耐藥基因dfrA1、鏈絲菌素耐藥基因sat1和鏈霉素耐藥基因aadA1。

隨著廣譜抗生素的廣泛使用，志賀菌屬耐藥率較前提高，多重耐藥株較前增多。1、2類整合子廣泛存在于志賀菌屬內(nèi)，部分菌株可能存在有1類整合子CS缺失或變異。

[1]Gassama Sow A,A?dara-Kane A,Barraud O,et al.High prevalence of trimethoprim-resistance cassettes in class 1 and 2 integrans in Sen?egalese Shigella spp isolates.[J].J Infect Dev Ctries,2010,4(4):207-212

[2]Ploy MC,Denis F,Courvalin P,et al.Molecular characterization of in?tegrons in Acinetobacter baumannii:Description of a hybrid class 2 integron[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(10):2684-2688.

[3]Dalsgaard A,Forslund A,Serichantalergs O,et al.Distribution and content of class 1 integrons in diferent Vibrio cholerae O-serotype strains isolated in Thailand[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(5):1315-1321.

[4]White PA,McIver CJ,Deng Y,et al.Characterisation of two new gene cassettes,aadA5anddfrA17[J].FEMS Microbiol Lett，2000,182(2):265-269.

[5]White PA,McIver CJ,Rawlinson WD.Integrons and gene cassettes in the Enterobacteriaceae[J].Antimicrob Agents Chemother，2001,45(9):2658-2661.

[6]施苗盛,陳文雨,沈嘉玲.志賀菌的菌型分布與耐藥性分析[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志,2008,7(9):94-95.

[7]施城東.178株福氏志賀菌的藥敏試驗結果及臨床應用分析[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2009,6(7):532

[8]Stokes HW,Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA ele?ments encoding site-specific gene-integration functions：integrons[J]．Mol Microbiol，1989，3(12):1669-1683

[9]Mammina C,Aleo A,Romani C，et al.Shigella sonnei biotype G car?rying class 2 integrons in southern Italy:a retrospective typing study by pulsed field gel electrophoresis[J].BMC Infect Dis,2006,6:117.

Survey of Antimicrobial Susceptibility and Integron Carriage of Shigella Isolates in Tianjin

WANG Jun,QI Wei,WU Jin,WANG Shuxiang,GUO Wenxue，MA Yanhong

Institute of Infection Disease,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective:To investigate changes in antibiotic resistance and carriage of class 1 and class 2 integrons of shi?gella isolates in Tianjin,China.Methods:A total of 57 clinical isolates of shigella identified in Tianjin during the years of 1981—1983 and 2009 were studied.Antibiotic susceptibility was detected by K-B disk diffusion method.Carriage of class 1 and class 2 integrons was investigated by polymerase chain reaction(PCR)with specific primers and confirmed by restriction endonuclease analysis of amplicons.Results were compared by BLAST program and GenBank database.Results:In the Shi?gella strains collected during the years of 1981—1983,the sensitive rates to tetracycline,streptomycin,chloromycetin and tri?methoprim-sulfamethoxazol were lower,and the multidrug resistant rate was 66.67%.In the other strains collected during the years 2009，the sensitive rates to ampicillin,streptomycin,trimethoprim-sulfamethoxazol,pailaxilin and tetracycline were lower,and the multidrug resistant rate was 83.33%.In the group during the years of 1981—1983,class 1 integrons were found in 87.88%(29/33)of Shigella isolates.Twenty-seven of these integron 1-positive isolates contained gene cassetteaa?dA,which confer resistance.Only the Shigella sonnei isolates contained gene cassettedfrA17+aadA5which confer trime?thoprim and streptomycin-resistance.None integron 2-positive isolates were found.In the other group during the years 2009,class 1 integrase were found in 79.17%(19/24)of Shigella isolates,however,variable region andconserved segment of class 1 integron were negative in all isolates.Class 2 integrons were present in 87.50%（21/24）of the Shigella isolates.All of these integron 2-positive isolates contained constant gene cassette arrays of dfrA1+sat1+aadA1,which confer trimethoprim,streptothricin and streptomycin-resistance to.Both class 1 and class 2 integrase were positive in 17 Shigella isolates.Conclu?sion:Antibiotic resistance has been developed in the evolution of Shigella strains.Integron carriage was very common in the shigella isolates.

shigella integrons drug tolerance disk diffusion antimicrobial tests polymerase chain reaction TIANJIN

10.3969/j.issn.0253-9896.2011.05.011

300211 天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津市感染性疾病研究所

△通訊作者 E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

（2010-06-01收稿 2010-08-10修回）

（本文編輯 魏杰）