韓 倩 張 山 喬玉敏 王春平 張志強(qiáng)

局麻藥所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）毒性驚厥為臨床上常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅著患者生命。大腦海馬是與驚厥的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系最為密切的區(qū)域之一，也是多種神經(jīng)毒性和損傷最為敏感的區(qū)域之一[1]。全身靜脈麻醉藥異丙酚起效迅速，用藥安全，并能迅速控制驚厥，縮短驚厥發(fā)作的持續(xù)時(shí)間[2]。本研究應(yīng)用左旋布比卡因、羅哌卡因及布比卡因致大鼠中毒驚厥模型，觀察不同局麻藥引起驚厥及異丙酚處理后海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、NO含量以及一氧化氮合酶（NOS）活性表達(dá)的差異，旨在比較異丙酚抑制這3種局麻藥所致驚厥的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 清 潔級(jí)成年Wistar大鼠64只，雄性，平均體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)均分為4組：對(duì)照組（C組）、左旋布比卡因組（L組）、羅哌卡因組（R組）及布比卡因組（B組），再按同源配對(duì)設(shè)計(jì)將每組再均分為實(shí)驗(yàn)(EG)組即C（EG）組、L（EG）組、R（EG）組以及B（EG）組;異丙酚處理（PG）組即C（PG）組、L（PG）組、R（PG）組以及B（PG）組，每組8只。

1.2 主要藥品與試劑 丙 泊酚注射液（進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20070378，費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，瑞典），0.75%鹽酸左旋布比卡因注射液（批號(hào)：H20020570，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），0.75%鹽酸羅哌卡因注射液（進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20020253,阿斯利康醫(yī)藥有限公司，瑞典）；一抗KIT-9901、酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州邁新生物科技有限公司），NO測(cè)定試劑盒和NOS測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí) 驗(yàn)開始前1 d所有鼠尾靜脈放置24號(hào)套管針。L組、R組及B組的實(shí)驗(yàn)組分別經(jīng)尾靜脈泵入0.75%左旋布比卡因、0.75%羅哌卡因以及0.75%布比卡因，速度均為2 mg·kg-1·min-1，PG組在出現(xiàn)驚厥反應(yīng)后靜脈注射2 mg/kg異丙酚。EG組以3 mL/h的速度泵入生理鹽水。驚厥發(fā)生2 h后所有大鼠處死、取腦，一側(cè)的海馬CA1區(qū)組織采用即用型非生物素免疫組化法（eliVision plus）觀察c-fos每400倍視野的細(xì)胞數(shù)即為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（cells/HP）。計(jì)算出各組的EG亞組和PG亞組的差值D與EG組的比值K（K=D/EG），K值增大表明處理組作用顯著。另一側(cè)的海馬CA1區(qū)組織放在冷凍管中，于液氮中凍存。按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定NO含量和NOS活性。Racine分級(jí)法判斷大鼠驚厥的程度：以大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)（全身不自主或不協(xié)調(diào)的抽搐）時(shí)為判定終止驚厥的標(biāo)準(zhǔn)，觀察大鼠的行為并記錄驚厥發(fā)作的潛伏期和發(fā)作程度。

1.4 觀察指標(biāo) 觀 察并比較各組驚厥發(fā)生的時(shí)間及局麻藥致驚厥的劑量，海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)、NO水平及NOS活性表達(dá)，比較各組上述3項(xiàng)指標(biāo)的K值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析、進(jìn)一步組間兩兩比較用LSD-t法，各組內(nèi)亞組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組驚厥情況 除C組外各組均有驚厥發(fā)生。各實(shí)驗(yàn)組從泵入局麻藥到出現(xiàn)驚厥的時(shí)間分別為：L組平均（10.63±4.81）min；R組平均（12.63±7.84）min；B組平均（7.75±3.92）min，各組局麻藥致驚厥劑量分別為（21.26±9.62）、（25.26±15.68）及（15.50±7.838）mg/kg。驚厥持續(xù)時(shí)間約為30~60 s，能自行停止。各異丙酚處理組在給予異丙酚后很快抑制驚厥。

2.2 各組c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)、NO含量和NOS活性表達(dá)比較 L（EG）、R（EG）和B（EG）組海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、NO含量以及NOS活性表達(dá)較C（EG）組均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。L（PG）、R（PG）和B（PG）組海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、NO含量以及NOS活性較各組內(nèi)相對(duì)應(yīng)的L（EG）、R（EG）和B（EG）組的表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)表1。

表1 各組海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)、NO含量和NOS活性的表達(dá) （±s）

表1 各組海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)、NO含量和NOS活性的表達(dá) （±s）

*P<0.05，**P<0.01

L（EG）（1）L（PG）（2）R（EG）（3）R（PG）（4）B（EG）（5）B（PG）（6）C（EG）（7）C（PG）（8）F P（1）∶（7）（3）∶（7）（5）∶（7）（1）∶（2）（3）∶（4）（5）∶（6）88888888 c-fos計(jì)數(shù)（cells/HP）105.31±13.570 73.970±8.331 115.750±11.450 79.838±7.882 198.625±22.791 99.038±11.828 14.575±4.4701 12.800±1.813 200.303**<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 NO含量（μmol/g）9.620±1.126 7.586±1.057 9.620±1.417 7.667±1.235 14.420±1.960 9.386±1.109 3.116±0.318 2.910±0.238 80.550**<0.001<0.001<0.001<0.001 0.002<0.001 NOS活性（×103U/g）0.332±0.045 0.248±0.034 0.326±0.068 0.250±0.047 0.822±0.092 0.477±0.062 0.104±0.045 0.104±0.026 115.224**<0.001<0.001<0.001<0.007<0.004<0.001組別 n

2.3 各組K值比較 L組與R組c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)K值、NO含量K值及NOS活性K值較B組均明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。L組與R組c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)K值、NO含量K值以及NOS活性K值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

異丙酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其單獨(dú)及復(fù)合其他麻醉藥均可抑制傷害性刺激引起的運(yùn)動(dòng)反應(yīng)[2-3]。目前異丙酚抗驚厥作用機(jī)制尚不明確，推測(cè)可能與丙泊酚減少興奮性氨基酸釋放、抑制鈣超載、降低NOS活性和抑制NO合成等有關(guān)[4]。本研究顯示，各異丙酚處理組在給予異丙酚后很快抑制驚厥，且多在15 s內(nèi)，頭面部及四肢抽搐甚至角弓反張消失，呼吸急促轉(zhuǎn)為平穩(wěn)而無(wú)呼吸抑制，整體處于安靜狀態(tài)，甚至有些大鼠在15 s靜脈注射異丙酚過(guò)程中即抑制驚厥，且異丙酚抑制各組驚厥發(fā)生的表現(xiàn)沒(méi)有明顯區(qū)別，表明2 mg·kg-1的異丙酚用量（誘導(dǎo)劑量）通常是安全的，對(duì)于局麻藥中毒驚厥的抑制作用完善、可靠。

c-fos基因在海馬CA1區(qū)組織受到輕微刺激時(shí)就能表達(dá)，在對(duì)海馬CA1區(qū)功能的分子水平的研究中起到至關(guān)重要的作用，驚厥發(fā)作時(shí)，在海馬CA1區(qū)見(jiàn)到較多的c-fos表達(dá)，2~4 h時(shí)達(dá)高峰期，8 h后降至正常[5]。在研究方法上，由于c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)于不同刺激選擇性差，易受其他非實(shí)驗(yàn)因素如光線、氣味和應(yīng)激的反應(yīng)等的干擾，因此，除嚴(yán)格控制合適的實(shí)驗(yàn)條件外，對(duì)于如何排除無(wú)關(guān)因素的干擾以求得結(jié)果的正確性顯得至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，L（EG）組、R（EG）組和B（EG）組的海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較C（EG）組均顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明實(shí)驗(yàn)組驚厥模型成功。

有研究顯示異丙酚可抑制數(shù)個(gè)不同腦區(qū)NOS的活性，減少NO與環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的生成，提示NO在異丙酚的作用機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用[6]。但這些實(shí)驗(yàn)均以翻正反射的消失作為產(chǎn)生麻醉狀態(tài)的指標(biāo)，只能表明NO與異丙酚的睡眠作用有關(guān)，未能進(jìn)一步探討其與異丙酚抗傷害作用的關(guān)系。Dillane等[7]研究表明異丙酚具有抗N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）作用，提示異丙酚可能是通過(guò)阻礙NMDA受體的激活、減少鈣離子內(nèi)流的方式進(jìn)一步導(dǎo)致NOS活性降低和NO合成減少。

本研究結(jié)果顯示，L（PG）、R（PG）和B（PG）組海馬CA1區(qū)c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、NO含量和NOS活性較各組內(nèi)對(duì)應(yīng)的L（EG）、R（EG）和B（EG）組均明顯降低，表明異丙酚均能抑制這3種局麻藥致驚厥引起的NO含量和NOS活性的增加，但L組與R組K值較B組NO含量和NOS活性K值明顯減小，考慮可能是異丙酚抑制的B組驚厥引起的NO含量和NOS活性變化強(qiáng)于L組和R組所致，但L組與R組K值相差不大，考慮可能是由于異丙酚抑制L組和R組驚厥引起的NO含量和NOS活性變化的作用相當(dāng)。

表2 3組K值比較 （ ±s）

表2 3組K值比較 （ ±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別L組R組B組F P L∶R L∶B R∶B n 16 16 16 c-fos計(jì)數(shù)K值0.295±0.027 0.311±0.023 0.502±0.023 171.939*0.239<0.001<0.001 NO含量K值0.212±0.230 0.204±0.016 0.347±0.017 99.558*0.196<0.001<0.001 NOS活性K值0.228±0.056 0.193±0.028 0.399±0.046 138.387*0.418<0.001<0.001

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