趙國燕,劉萬順,韓寶芹,梁 曄

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003)

低分子量氨基糖及其衍生物對角膜細胞生長影響的研究*

趙國燕,劉萬順**,韓寶芹,梁 曄

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003)

體外培養(yǎng)兔角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞,采用顯微觀察和MTT相結(jié)合的方法分析低分子量氨基糖(包括殼寡糖(chitosan)、羧甲基殼寡糖(Carboxymethyl chitosan oligosaccharide)、羧甲基甲殼寡糖(Carboxymethyl chitin oligosaccharide)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine))對細胞生長的影響。結(jié)果在0～1000μg/mL濃度范圍內(nèi)4種氨基糖對角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞均沒有細胞毒性,且均能促進角膜上皮細胞的生長,以殼寡糖和羧甲基甲殼寡糖效果最佳,二者與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。殼寡糖、羧甲基甲殼寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖能明顯促進角膜基質(zhì)細胞的生長,與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05),其中殼寡糖的促進作用最明顯。提示低分子量氨基糖可適用于角膜細胞促生長的培養(yǎng),為殼聚糖衍生物材料用于眼科研究提供一定的實驗依據(jù)。

殼寡糖;羧甲基甲殼寡糖;角膜上皮細胞;角膜基質(zhì)細胞

甲殼素是自然界含量僅次于纖維素的第二大生物大分子多糖,經(jīng)脫乙?；芍频脷ぞ厶?目前在醫(yī)藥衛(wèi)生、生物醫(yī)用材料、健康食品、精細化工、生物工程等領(lǐng)域都有廣泛的研究。甲殼素經(jīng)酸、生物酶等選擇性可控降解,可制得甲殼寡糖和單糖;殼聚糖經(jīng)酸或生物酶選擇性降解,可制得殼寡糖;寡糖經(jīng)羧甲基化可制得羧甲基甲殼寡糖和羧甲基殼寡糖。

氨基寡糖及單糖對于細胞生長作用的研究有較多報道[1-3],如對胰島B細胞、成骨細胞生長均有明顯的促進作用,并且能夠促進神經(jīng)干細胞的分化。到目前為止低分子量氨基糖及其衍生物對角膜細胞生長影響的報道較少。

本實驗以兔角膜細胞為研究對象,從細胞水平上評價殼寡糖(COS)、羧甲基殼寡糖(CMCOS)、羧甲基甲殼寡糖(CMCTOS)、N-乙酰氨基葡萄糖(NA G)對角膜細胞生長的影響,探索低分子量氨基糖在角膜細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用價值,同時為殼聚糖類生物材料應(yīng)用于眼科研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

(1)4種低分子量氨基糖:殼寡糖(COS,MW=1413Da,脫乙酰度90.15%),羧甲基殼寡糖(CMCOS,MW=6546Da,脫乙酰度88.68%,取代度67.31%),羧甲基甲殼寡糖(CMCTOS,MW=1961Da,脫乙酰度29.88%,取代度70.87%),N-乙酰氨基葡萄糖(NAG),以上材料均由本實驗室制備并純化。L929細胞毒性試驗結(jié)果顯示4種氨基糖均沒有細胞毒性,生物相容性良好。使用時分別加細胞培養(yǎng)基溶解,經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌,并稀釋至不同濃度。

(2)實驗動物:新西蘭兔,1月齡,雌雄各半,購自山東省農(nóng)科院。

(3)實驗試劑:DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)、小牛血清(Hyclone)、胰酶(Gibco)、MTT(Sigma)。二甲基亞砜(DMSO)和配制D-Hanks液所需的化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 實驗儀器 HF Safe 760S超凈工作臺、HF90 CO2細胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司),IX 70 O-lympus倒置顯微鏡(日本Olympus),LabsystemsMultiskan Mk3酶標儀(芬蘭雷勃),96孔培養(yǎng)板(Costa)。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的分離與傳代培養(yǎng)

麻醉處死動物,無菌取出眼球,去除冗余組織,無菌生理鹽水沖洗后,放入含2 000 U/mL的硫酸慶大霉素生理鹽水中浸泡20 min,于無菌條件下沿角膜緣取下角膜,解剖鏡下將其組織剝離,分離出上皮層、基質(zhì)層、內(nèi)皮層3部分,將上皮層和基質(zhì)層分別剪成2 mm×2 mm小組織塊,分別貼附于25 mL的細胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁4 h,然后加入含15%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基1 mL,繼續(xù)培養(yǎng)。2 d后補加培養(yǎng)基至3 mL,每3 d換液1次。當(dāng)組織塊周圍有大量細胞遷出,并出現(xiàn)大量細胞融合時,用0.25%胰酶液消化并傳代培養(yǎng),分別制得大量角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞。

1.2.2 MTT法測定不同氨基糖對角膜上皮細胞生長的影響 取傳代培養(yǎng)1～2次的角膜上皮細胞制備細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為105/mL,接種于96孔板中,每孔接種200μL,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后吸出原培養(yǎng)液,對照組加200μL常規(guī)細胞培養(yǎng)液,實驗組分別加入含有不同氨基糖的細胞培養(yǎng)液200μL,氨基糖的終濃度分別為62.5、125、250、500和1 000 μg/mL,空白對照組僅加相應(yīng)的培養(yǎng)液,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于2和4 d后,在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)、拍照。加入5 mg/mL的MTT液20μL繼續(xù)孵育4 h,吸去孔中液體,加入150μL二甲基亞砜,于492 nm處比色測定。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 MTT法測定不同氨基糖對角膜基質(zhì)細胞生長的影響 取傳代培養(yǎng)3～4代的角膜基質(zhì)細胞,消化制備細胞懸液,以2×104/mL的細胞濃度接種于96孔板中,每孔接種200μL;其余步驟同1.2.2。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 結(jié)果用mean±SD表示。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件,采用One-way ANOVA進行多組樣本均數(shù)的比較,組間比較采用Duncan’s法,顯著性界值設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)

組織培養(yǎng)24 h時角膜上皮組織邊緣即有不規(guī)則細胞遷出(見圖1)。培養(yǎng)至48 h時組織邊緣遷出較大面積細胞生長暈,細胞呈多邊形,胞漿豐富,細胞之間排列緊密。至96 h時多數(shù)細胞融合。原代上皮細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)24 h時細胞貼壁并伸展,后續(xù)培養(yǎng)細胞不斷增殖,到144 h細胞鋪滿瓶底,并出現(xiàn)細胞融合現(xiàn)象(見圖2)。

圖2 傳代培養(yǎng)角膜上皮細胞(×100)Fig.2 Subcultured corneal epithelial cells(×100)

組織培養(yǎng)72 h角膜基質(zhì)細胞緩慢從組織塊中遷出(見圖3),細胞呈梭形或成纖維狀,隨培養(yǎng)時間延長細胞不斷增殖,到144 h時細胞融合,并呈現(xiàn)明顯的生長極性。

圖3 角膜基質(zhì)層遷出基質(zhì)細胞(×100)Fig.3 The corneal stroma moved out stromal cells(×100)

2.2 低分子量氨基糖對角膜上皮細胞生長的影響

2.2.1 低分子量氨基糖對角膜上皮細胞生長狀態(tài)的影響 鏡下可見,各組細胞形態(tài)良好,細胞飽滿,胞漿豐富,培養(yǎng)2和4 d時COS、NAG和CMCTOS組細胞密度均大于對照組。隨培養(yǎng)時間延長,細胞密度不斷增大,培養(yǎng)至4 d時(見圖4)COS各組、NA G低濃度組和CMCTOS低濃度組細胞鋪滿96孔板孔底,細胞伸展平鋪傾向略大于2 d時。CMCOS各組與對照組細胞密度無明顯差異。

圖4 角膜上皮細胞培養(yǎng)4 d時各組細胞形態(tài)(×100):Fig.4 The cells morphology of every group when cultured for 4 days(×100)

2.2.2 MTT法測定低分子量氨基糖對角膜上皮細胞生長的作用 MTT法測定結(jié)果(見圖5)顯示NA G、COS、CMCOS和CMCTOS在本實驗濃度下對角膜上皮細胞生長均沒有毒性,且對細胞均有一定的促增殖作用,以低濃度下各種糖對促細胞生長較為明顯,但COS在較高濃度均能促進角膜上皮細胞的生長。NA G、CMCOS、CMCTOS的最適濃度為62.5 μg/mL,COS為250μg/mL,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。此外隨培養(yǎng)時間,2 d時COS的促增長作用表現(xiàn)最明顯,4 d時CMCTOS對細胞促生長作用最明顯(見圖6)。

圖5 培養(yǎng)2、4 d時不同濃度氨基糖對角膜上皮細胞生長的影響Fig.5 The effect of different concentrations of saccharides on the growth of corneal epithelial cells cultured for 2 or 4 days

圖6 培養(yǎng)4 d時角膜基質(zhì)細胞生長狀態(tài)(×100)Fig.6 The cells morphology of every group when cultured for 4 days(×100)

2.3 低分子量氨基糖及其衍生物對角膜基質(zhì)細胞生長的影響

2.3.1 低分子量氨基糖及其衍生物對角膜基質(zhì)細胞生長狀態(tài)的影響 用不同濃度的糖培養(yǎng)液培養(yǎng)角膜基質(zhì)細胞,分別于2和4d時觀察角膜基質(zhì)細胞的生長狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞生長良好,細胞呈長梭形、胞漿豐富、胞體透明。COS各組、NAG低濃度組和CMCTOS低濃度組細胞密度明顯高于不加糖的對照組(見圖6),4 d時實驗組細胞鋪滿孔底,而對照組仍未鋪滿孔底。CMCOS各組細胞形態(tài)與其他組相似,但細胞密度與對照組無明顯差異。

2.3.2 MTT法測定低分子量氨基糖對角膜基質(zhì)細胞生長的作用 MTT法測定結(jié)果(見圖7)顯示4種低分子量氨基糖在0～1 000μg/mL范圍內(nèi)對角膜基質(zhì)細胞生長均沒有細胞毒性。細胞培養(yǎng)2 d時,COS和NAG對細胞生長有明顯的促進作用(P<0.05),其最適濃度均為125μg/mL。4 d時COS和CMCOT明顯地促進細胞的生長(P<0.05),最適濃度均為125μg/mL。CMCOS對角膜基質(zhì)細胞生長無明顯的作用。

圖7 培養(yǎng)2、4 d時不同濃度氨基糖對角膜基質(zhì)細胞生長的影響Fig.7 The effect of different concentrations of saccharides on the growth of corneal stromal cells cultured for 2 or 4 days

3 討論

隨著組織工程的興起,組織工程角膜的制備成為研究的熱點[4]。體外培養(yǎng)角膜細胞不僅為組織工程角膜提供種子細胞,更為支架材料的篩選以及藥物檢測提供細胞來源[5-6]。隨著研究的深入角膜細胞的體外培養(yǎng)取得良好的進展[7-8],但如何獲得批量、高活性且與體內(nèi)細胞相同的角膜細胞依然是需要解決的問題。本實驗采用組織貼壁法體外原代培養(yǎng)角膜上皮細胞和角膜基質(zhì)細胞,經(jīng)傳代后獲得大量高活性的角膜細胞,為后續(xù)材料的細胞評價提供了豐富的細胞來源。

研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖及其單糖具有較好的促細胞生長的作用。房子等[9]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖對異丙腎上腺素損傷的心肌細胞具有顯著的保護作用,且能抑制心肌細胞凋亡。不同分子量的殼寡糖對胰島B細胞體外增殖具有明顯的促進作用,能明顯促進成骨細胞增殖,能夠促進神經(jīng)干細胞的分化和神經(jīng)生長。

本研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖、羧甲基殼寡糖、羧甲基甲殼寡糖對角膜上皮細胞和角膜基質(zhì)細胞生長均沒有毒性,并且殼寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖和羧甲基甲殼寡糖能明顯地促進角膜2種細胞的生長。提示殼寡糖及其衍生物可用于角膜細胞的培養(yǎng)。

近年來在組織工程角膜的研究開發(fā)中,支架材料的篩選是其研究的重要方面。殼聚糖及其大分子衍生物具備良好的生物相容性和可降解性,不少學(xué)者致力于其在組織工程角膜中的應(yīng)用研究,并取得良好的成果。高興爽等[10]研究發(fā)現(xiàn)羥丙基殼聚糖對角膜基質(zhì)細胞生長有一定的促進作用,采用羥丙基殼聚糖、明膠、硫酸軟骨素共混制得的組織工程角膜膜片具有良好的細胞相容性。王詩路等[11]用羥丙基殼聚糖、明膠和硫酸軟骨素按一定比例共混制備三維支架材料,并接種角膜基質(zhì)細胞,細胞在材料上生長良好,兔眼內(nèi)植入實驗效果亦佳。本研究結(jié)果表明低分子氨基糖及其衍生物對角膜上皮細胞和基質(zhì)細胞生長均沒有細胞毒性,且有一定的促細胞生長作用,為殼聚糖類材料在組織工程角膜中的應(yīng)用提供了良好的理論支撐。

[1] 劉冰,秦貞奎,林祥梅,等.不同分子量殼寡糖對促胰島細胞增殖、胰島素分泌及調(diào)節(jié)餐后血糖的作用[J].世界華人消化雜志,2009,17(1):36-42.

[2] 金黎明,魏長征,田文杰,等.殼寡糖及其衍生物對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖的作用特點[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(19):3637-3640.

[3] 楊宇民,林社裕,劉梅,等.殼寡糖對神經(jīng)干細胞分化的影響[J].交通醫(yī)學(xué),2007,21(6):623-626.

[4] 范先群.組織工程角膜的研究現(xiàn)狀和存在的問題[J].上海交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2008,28(6):619-62.

[5] Federico Castro-Munozledo.Corneal epithelial cell cultures as a tool for research,drug screening and testing[J].Experimental Eye Research,2008,86:459-469.

[6] Liu Jingbo,Song Ge,Wang Zhichong,et al.Establishment of a corneal epithelial cell line spontaneously derived from human limbal cells[J].Experimental Eye Research,2007,84:599-609.

[7] 張敏,鐘良玉.角膜上皮細胞體外培養(yǎng)的研究進展[J].中國中西醫(yī)眼科雜志,2008,18(1):56-58.

[8] 任玫卿,欒潔.兔角膜上皮細胞體外原代培養(yǎng)方法的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2008,27(2):90-94.

[9] 房子,韓寶芹,劉萬順,等.殼寡糖及其衍生物對大鼠受損心肌細胞和組織的保護作用[J].高技術(shù)通訊,2005,15(11):96-100.

[10] 高興爽,劉萬順,韓寶芹,等.殼聚糖基角膜細胞載體的制備及其細胞相容性[J].生物工程學(xué)報,2008,24(8):1381-1386.

[11] 高興爽,劉萬順,韓寶芹,等.羥丙基殼聚糖的制備、表征及其對角膜細胞生長的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,37(增刊Ⅱ):131-134.

[12] Wang Shilu,Liu Wanshun,Han Baoqin,et al.Study on a hydroxypropyl chitosan-gelatin based scaffold for corneal stroma tissue engineering[J].Applied Surface Science,2009,255:8701-8705.

The Effect of Low Molecular Amino Saccharides and Their Derivatives on Corneal Cells Growing

ZHAO Guo-Yan,LIU Wan-Shun,HAN Bao-Qin,LIANG Ye
(College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Rabbit corneal epithelial cells and stromal cells were cultured in vitro.The effect of low molecular weight amino saccharides which included chitosan,carboxymethyl chitosan oligosaccharide,carboxymethyl chitin oligosaccharide and N-acetyl-glucosamine on cells were observed by using microscopic observation and the MTT method.The results showed that,in the concentration range of 0 to 1 000μg/mL,these four kinds of amino saccharides were not cytotoxic on corneal epithelial cells and stromal cells.At the same time,they could promote the growth of corneal epithelial cells.Chitosan and carboxymethyl chitin oligosaccharide were the better.There were significant differences,compared with the control group as well(P<0.05).Chitosan,carboxymethyl chitin oligosaccharide and N-acetyl-glucosamine could significantly promote the growth of corneal stromal cells,while chitosan was the most obvious.There were significant differences,compared with the control group(P<0.05).The results promptd that low molecular weight amino saccharides could be applied to promote the growth of corneal cells in vitro culture and provide some experimental basis for chitosan derivative materials used for ophthalmic research.

chitosan;carboxymethyl chitin oligosaccharide;corneal epithelial cells;corneal stromal cells

R99

A

1672-5174(2011)03-052-05

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃重點項目(2007AA091603,2006AA02A132)資助

2010-02-23;

2010-04-28

趙國燕(1986-),女,碩士生。E-mail:yanguoz@126.com

**通訊作者:E-mail:wanshunliu@hotmail.com

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)