王青林,董云偉,董雙林**,王 芳,宋文華,于姍姍

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003;2.廈門大學海洋與環(huán)境學院,福建廈門361005)

高溫刺激對刺參浮游期幼體存活率及Hsp70表達量的影響*

王青林1,董云偉2,董雙林1**,王 芳1,宋文華1,于姍姍1

(1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003;2.廈門大學海洋與環(huán)境學院,福建廈門361005)

設計不同溫度(21.5,26,28和30℃),對刺參(A postichopus japonicus)囊胚期、原腸期和耳狀幼體期幼體進行熱激處理,熱激45 min后,將幼體在21.5℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至耳狀幼體后期,計算刺參幼體的存活率,并用蛋白雜交方法測定幼體Hsp70的表達量。結果表明,高溫刺激對幼體的存活有顯著性影響,各時期幼體的存活率均隨熱激溫度的升高而降低,原腸期的存活率要高于囊胚期和耳狀幼體時期。原腸期幼體Hsp70表達量要比囊胚期和耳狀幼體時期高,這表明在發(fā)育過程中Hsp70表達量與幼體存活率具有相關性。

高溫刺激;刺參;幼體;熱休克蛋白;發(fā)育

刺參(A postichopus japonicus)是我國北方的一個重要養(yǎng)殖品種,市場需求日益增加。由于刺參對高溫的耐受性低,養(yǎng)殖區(qū)域和生長時間受到了極大的限制。溫度刺激所誘導的保護作用在海洋生物中已有研究[1-2]。張其中等[3]發(fā)現(xiàn)近江牡蠣預先經(jīng)受亞致死溫度熱休克以后,顯著提高了對高溫的耐受能力,這種保護作用與生物體內熱休克蛋白的表達具有重要關系[4]。

熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是1種高度保守的蛋白質,具有防止蛋白變性,使變性蛋白復性的重要功能,其中分子量為66～78 kDa的熱應激蛋白70(Hsp70)家族由于其保守性、重要性和在應激反應中的敏感性,受到廣泛重視[5]。有研究表明少量誘導型熱休克蛋白的表達能顯著地影響生物的生長、發(fā)育、熱耐受性、壽命以及繁殖[6-11]。目前,對于刺參的研究已經(jīng)證實Hsp70在抵抗高溫和滲透壓脅迫中具有重要作用[4,12-14]。同時HSPs的累積與機體耐受性的提高有一定的相關性[15]。本實驗通過檢測不同熱激條件下刺參浮游期幼體存活率和Hsps的含量,探討Hsp70表達與幼體存活率之間的關系,分析不同發(fā)育時期刺參幼體對溫度應激的敏感性,豐富刺參溫度生理生態(tài)學研究,并為耐高溫品系篩選提供一定的理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料來源

實驗所需幼體來自山東省膠南市育苗場的親參,干法運至實驗室后,在18℃暫養(yǎng)5 d,人工誘導產(chǎn)卵并培育而得。卵子和精子在21.5℃水溫下孵化,受精卵的密度控制在10～20 inds/mL,在原腸期幼蟲后期投喂牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、杜氏鹽藻(Dunaliella salina)和海洋紅酵母的混合液,投喂量依據(jù)刺參的不同發(fā)育時期、幼體的攝食活力以及水體中剩余的餌料數(shù)量而做適當?shù)恼{整。整個苗種培育期間不間斷充氣,光照強度控制在500～1500 lux,光照周期為14 L∶10 D。水源為沙濾自然海水。每天換水1/2,海水鹽度為30左右,換水前對海水進行預加熱,防止換水造成水族箱溫度變化過大。

1.2 實驗設計

1.2.1 高溫刺激對刺參浮游期幼蟲存活率的影響

在囊胚期、原腸期以及耳狀幼體初期,將幼體分別轉移到26,28和30℃進行高溫應激處理,持續(xù)時間為45 min,然后再轉移到21.5℃繼續(xù)培育至耳狀幼體后期,每個處理3個重復,21.5℃培育下的不進行高溫應激處理的幼體作為對照。分別于實驗開始前及耳狀幼體后期記錄水體中幼體的數(shù)量。

1.2.2 不同發(fā)育時期刺參幼體Hsp70含量變化 在受精卵、囊胚期、原腸期以及耳狀幼體初期,將幼體分別轉移到不同溫度(26,28和30℃)進行熱激處理,持續(xù)時間為45 min,然后再轉移到21.5℃繼續(xù)培育,2 h后取大約8 000個幼體液氮保存,同時取未高溫應激的幼體作為對照,每個處理3個重復。

1.3 樣品處理

在預冷的研缽內加入液氮低溫研磨刺參幼體,然后加入適量含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液在冰浴中勻漿。勻漿完畢后4℃下10 000 g 15 min,取上清液保存在-70℃超低溫冰箱中。

1.4 蛋白雜交

以牛血清蛋白為標準方法參照Lowry等[16]測定樣品中蛋白含量。Hsp70和Hsp72含量的測量方法參照Dong等[17]。蛋白的凝膠電泳選用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳[18]。取40μg蛋白加適量體積上樣緩沖液(含DTT)煮沸5 min,進行電泳,然后參照Kyhse-Andersen[19]的方法將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質轉移到0.45μm的PVDF膜上利用脫脂奶粉封閉后,用單克隆抗Hsp70抗體,(H5147,Sigma,USA),在37℃孵育2 h(稀釋1∶5000)。然后將膜在抗小鼠IgG(HRP)(ZB2305,中杉金橋,北京,中國)抗體中孵育1.5 h,采用ECL試劑(Amersham,USA)顯色,曝光,條帶強度采用Image J軟件進行定量分析。

本實驗標準值采用30℃條件下熱激的受精卵樣品,實驗結果中的Hsp水平均為相對于標準樣品水平的值(RU)。

1.5 計算與數(shù)據(jù)分析

實驗期間幼體存活率(SR)采用以下公式計算:SR=N2/N1×100%,N1,N2分別為初始時期和耳狀幼體后期幼體數(shù)量。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS13.0進行,不同熱激溫度和不同發(fā)育時期的差異采用雙因子方差分析(Two-way ANOVA),以P<0.05作為差異顯著的標準。

2 結果

2.1 高溫應激對刺參浮游期幼蟲存活率的影響

在幼體生長的最適溫度下(21.5℃),不同發(fā)育時期(囊胚期BLA、原腸期GAS以及耳狀幼體期AUR)幼體的存活率不同(見圖1)。其中囊胚期的存活率最高,為81.96%,顯著高于耳狀幼體期的70.0%(P<0.05),和原腸期的存活率(79.71%)沒有顯著差異。

雙因子方差分析結果表明,熱激溫度和發(fā)育時期對刺參幼體存活率差值影響顯著(見表1),溫度和發(fā)育時期具有顯著交互作用(P<0.001)。隨著熱激溫度的升高,不同浮游期的刺參幼體的存活率呈下降的趨勢,其中熱激組與對照組幼體的存活率差值呈下降趨勢(見圖2)(BLA-26,-21.52%;BLA-28,-34.52%;BLA-30,-49.06%;GAS-26,-10.95%;GAS-28,-15.22%;GAS-30,-28.51%;AUR-26,-17.04%;AUR-28,-35.37%;AUR-30,-36.94%)。在囊胚期和原腸期,不同溫度處理組之間差異顯著(P<0.05)。在耳狀幼體時期,26℃熱激組幼體的存活率顯著高于其它2組,其它2組差異不明顯。

表1 不同溫度熱激對刺參不同浮游期幼體存活率影響的方差分析Table 1 Two-way ANOVO analysis of the effect of heat-shock temperature on survival rate ofA postichopus japonicuslarvae in different developmental stages

圖1 不同浮游時期刺參存活率Fig.1 Survival rate of larvae at the stage of blastula,gastrula and auricularia inA postichopus japonicus

圖2 熱激對刺參浮游期幼體存活率的影響Fig.2 Survival rate of larvae stressed at the stage of blastula,gastrula and auricularia of sea cucumber A postichopus japonicus

2.2 刺參浮游幼體Hsp70的表達

2.2.1 熱激溫度對不同發(fā)育時期刺參幼體Hsp70表達量的影響 熱激溫度對不同發(fā)育時期刺參幼體Hsp70表達量的影響不同(見圖3)。受精卵時期,隨著熱激溫度的升高Hsp70的表達量增加,但是30℃時,表達量明顯低于其它3組(P<0.05)。囊胚時期,對照組有少量Hsp70表達,但是熱激組沒有檢測到有Hsp70表達(RU=0)。隨著熱激溫度的升高,原腸期幼體Hsp70的表達量呈下降的趨勢,并且各處理組之間差異顯著(P<0.05)。耳狀幼體時期,沒有檢測到Hsp70的表達。

圖3 熱激溫度對不同發(fā)育時期刺參幼體Hsp70表達量的影響Fig.3 Expression of Hsp70 of larvae stressed at pelagic stages of sea cucumberA postichopus japonicus

圖4 熱激溫度對不同發(fā)育時期刺參幼體Hsp72表達量的影響Fig.4 Expression of Hsp72 of larvae stressed at pelagic stages

2.2.2 熱激溫度對不同發(fā)育時期刺參幼體Hsp72表達量的影響 熱激溫度對不同發(fā)育時期刺參幼體Hsp72表達的影響不同(見圖4)。受精卵時期,Hsp72表達量隨著溫度的升高而增加,30℃條件下的表達量最高,顯著高于其它3組(P<0.05)。28℃條件下的表達量顯著高于21.5℃和26℃條件下的表達量,21.5℃和26℃條件下的表達量沒有顯著差異。囊胚時期,對照組有少量Hsp72表達,但是熱激組沒有檢測到表達量。原腸時期,對照組有很高的Hsp72表達量,并且顯著高于處理組(P<0.05),從26℃升高到28℃時,Hsp72的表達量隨之增加,且2組之間的差異顯著(P<0.05)。但是熱激溫度從28℃升高到30℃時,Hsp72的表達量呈下降的趨勢,但差異不顯著。耳狀幼體時期,檢測不到Hsp72的表達。

3 討論

3.1 熱激對刺參浮游期幼蟲存活率的影響

水溫是影響水生變溫動物生長和其他生理過程的重要生態(tài)因子之一。有研究表明刺參幼體發(fā)育的最適溫度為20～25℃[20-22],因此本實驗選擇21.5℃條件下的幼體發(fā)育為對照。溫度能顯著影響到刺參幼體的存活率[23]。本實驗結果表明,在浮游幼體時期對刺參進行高溫應激使得幼體存活率顯著下降,存活率隨著熱激溫度的升高而降低(見圖2),且不同發(fā)育時期的刺參幼體對熱激的敏感性不同。Chen[24]發(fā)現(xiàn)耳狀幼體對環(huán)境的改變非常敏感,在此時期經(jīng)常會出現(xiàn)大規(guī)模的幼體死亡。本實驗的結果表明,相對囊胚期和耳狀幼體時期的幼體,原腸期幼體在高溫下存活率要比其它2個時期高,說明原腸期對高溫的耐受性較強,而囊胚期和耳狀幼體時期的幼體對熱激較為敏感,這2個時期應該是篩選耐高溫刺參的合適時期。劉廣斌[25]研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖環(huán)境的高溫條件可以影響刺參對溫度的耐受能力,并且這種能力是可以遺傳的。故在囊胚期或者耳狀幼體時期對幼體進行熱激,是培育耐高溫的刺參品系的一種途徑。

3.2 刺參浮游幼體Hsp的表達

本實驗表明,刺參受精卵、囊胚期以及原腸期都能檢測到熱休克蛋白表達,但是Hsp70具有2種單倍型,2種單倍型的表達模式有明顯差別(見圖3,4)。

就Hsp70的表達來說,受精卵時期,隨著熱激溫度的升高,Hsp70的表達量隨之增加,這表明當溫度超過26℃時,刺參幼體會適應性的誘導產(chǎn)生熱休克蛋白。但30℃條件下的Hsp70表達急劇降低,且顯著低于其它3組(P<0.05),表明30℃已經(jīng)超過幼體誘導產(chǎn)生熱休克蛋白的上限。囊胚期,對照組有少量的Hsp70表達,但是當熱激溫度超過最適溫度時,其表達量為零。原腸期,Hsp70的表達量隨著熱激溫度的升高而顯著下降(P<0.05)。在30℃下,各時期的幼體Hsp70表達量均有不同程度的降低,其表達量的下調與高溫下機體整體蛋白合成降低有關[26]。如果過度刺激就會造成受刺激者整體處于不適狀態(tài),從而無法及時合成足夠熱休克蛋白,以對付有害刺激的傷害,嚴重時會導致死亡。Tedengren等[27]發(fā)現(xiàn)過度的熱和鎘離子濃度聯(lián)合處理紫貽貝造成“生理適應度”降低,從而降低了Hsp70的表達水平。

受精卵期Hsp72表達量隨著熱激溫度的升高,其表達量隨之升高,此種蛋白表達量的上調表明熱休克蛋白的表達受溫度的誘導,Hsp70的表達與溫度具有相關性[28]。當溫度超過生物體的最適應溫度時,某些蛋白喪失結構和活性,導致Hsp表達來重折疊變性蛋白和阻止更多的聚集[5]。囊胚期,Hsp72表達量趨勢與Hsp70相同。原腸期,對照組表達量顯著高于處理組(P<0.05),處理組表達量隨著熱激溫度的升高呈先升后降趨勢。

總體來說,不同時期2種單倍型熱休克蛋白(Hsp70和Hsp72)的表達具有共同趨勢:原腸期的表達量要高于囊胚期和耳狀幼體期,而原腸期的存活率也高于囊胚期和耳狀幼體期,表明兩者具有一定的相關性。Dong等[29]通過研究位于高低潮區(qū)域的4種帽貝發(fā)現(xiàn),高潮線附近的種類具有較高的Hsp70表達量。表明熱休克蛋白在提高機體耐受性方面起著重要的作用。Hsp70可以增強機體的應激耐受性,提高細胞生存率?；镜募毎绦蛉甾D錄、翻譯、轉運經(jīng)過輕微熱預處理后,在隨后的應激過程中可以得到保護。這樣不僅能使細胞的耐受性增加,而且能使細胞對其它應激原的耐受性也增加[30]。耳狀幼體期沒有Hsp的表達,可能是表達量太少,蛋白免疫印記無法檢測,有研究表明Hsp在棘皮動物海膽胚胎時期的表達時期以及表達量因種而異[31-38],其具體原因有待進一步研究。

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Effects of Heat-Shock in Pelagic Stages on Survival and Hsp70 Expression of Juvenile Sea Cucumber,Apostichopus japonicus Selenka

WANG Qing-Lin1,DONG Yun-Wei2,DONG Shuang-Lin1,WANG Fang1,SONG Wen-Hua1,YU Shan-Shan1
(1.The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,College of Fisheries,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.College of Oceanography,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

The effects of heat-shock in pelagic stages on survival and Hsp70s expression of juvenile sea cucumber,A postichopus japonicusSelenka were investigated.Larvae at the stage of blastula,gastrula and auricularia were heat-shocked at selected temperatures(21.5,26,28 and 30℃)for 45 min and returned to 21.5℃for continuous rearing.After the heat-shock,there were significant differences in survival among larvae in the four heat-shocked treatments.The survival rate of larvae decreased with the increasing of heat-shock temperature,and the rate was higher in the stage of gastrula than those in blastula and auricularia.The Hsp70s expression of larvae in the stage of gastrula was higher than those in the stages of blastula and auricularia,suggesting that the survival of larvae partly correlates with the expression of Hsp70s.

heat-shock;sea cucumber;larvae;heat shock protein;development

S917.4

A

1672-5174(2011)03-047-05

國家科技支撐計劃項目(2006BAD09A01);山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金計劃項目(BS2009NY019)資助

2010-05-28;

2010-11-03

王青林(1984-),男,博士生。E-mail:wangqinglin2009@gmail.com

**通訊作者:E-mail:dongsl@ouc.edu.cn

責任編輯 于 衛(wèi)