(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯154007)

稻殼中黃酮類化合物的微波提取及其抗氧化活性研究

張羽男,蘇宏宏,江 惠,李亞菲,黃 強(qiáng),劉 楝,孫 旭,周 維,胡月茹,李澤涵

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯154007)

目的:研究稻殼中總黃酮的最佳提取工藝及其抗氧化作用。方法:提取工藝采用微波法,以總黃酮提取率為考察指標(biāo),選用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn);抗氧化試驗(yàn)采用Fenton反應(yīng)法和烘箱儲(chǔ)藏法,通過(guò)比較吸光度和POV值研究其抗氧化活性。結(jié)果:最佳的提取條件為乙醇濃度70%,提取時(shí)間120s,固液比1g¨10mL,微波功率700 W,提取率可達(dá)0.313%;抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明,稻殼中提取的總黃酮具有較強(qiáng)的清除羥基自由基能力和阻斷豬油自氧化作用的能力。結(jié)論:稻殼中提取的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性。

稻殼;黃酮類化合物;微波提取法;抗氧化性

稻殼又名碧糠或大糠,按質(zhì)量計(jì)約占稻谷的20%,是碾米廠的主要副產(chǎn)品之一。每年我國(guó)稻殼年產(chǎn)量可達(dá)8000多萬(wàn)噸,但由于稻殼本身密度小,難于運(yùn)輸和貯存;外殼堅(jiān)硬,不易被土壤消化;營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低,不適合作飼料;所含纖維短,不適合造紙,常被視為廢棄物而燃燒掉,沒(méi)有被很好地開發(fā)和利用[1]。然而,研究表明,稻殼中含有許多如黃酮、低聚木糖及綠原酸等具有較高藥用價(jià)值的活性成分[2]。其中,黃酮類化合物具有抗氧化、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、降血脂及治療心腦血管疾病等多方面的生理功效[3,4]。因此,如何綜合有效地利用廢棄稻殼生產(chǎn)具有醫(yī)用保健功能的黃酮類化合物,就極具學(xué)術(shù)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究以稻殼為原料詳細(xì)研究了微波提取分離黃酮類化合物的方法與條件,建立了最佳提取與純化工藝,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究,為利用廢棄稻殼工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類藥用保健成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、試劑、儀器

1.1 主要材料

原料:水稻谷殼,簡(jiǎn)稱稻殼,來(lái)源于黑龍江省樺南縣。

試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,上海生化制劑廠。三氯甲烷、KI、H2O2、冰乙酸、FeSO4、NaOH、水楊酸等均分析純。

1.2 主要儀器

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);FA 2004電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);格蘭仕G70D20N 1L-M1(SO)微波爐(格蘭仕公司);Spectrum lab-54型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁對(duì)照品25.0mg,80%乙醇溶解后,移至100mL容量瓶,定容。精密吸取2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0mL分置于50mL容量瓶中,分別加入5%NaNO2溶液1.5mL,混勻,放置6min,加入10%的Al2(SO4)3溶液1.5mL,混勻,放置6min,加4%NaOH溶液20mL,加水至刻度,搖勻,放置15min。在510nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定其紫外吸光度。以吸光度值(A)為縱坐標(biāo),蘆丁溶液的濃度(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 原材料的預(yù)處理

本試驗(yàn)所用稻殼來(lái)源于黑龍江省樺南縣農(nóng)戶,采用乙醇作為溶劑。當(dāng)乙醇作溶劑時(shí),不可避免的將脂溶性色素一起提取出來(lái),這將對(duì)結(jié)果分析帶來(lái)不必要的干擾,故原料預(yù)先進(jìn)行石油醚脫脂、脫色素,以排除干擾。具體方法為:將稻殼清洗干凈,置于60℃恒溫干燥箱內(nèi)進(jìn)行烘干(24h),取出后粉碎過(guò)篩,然后將稻殼用索氏提取法(石油醚為抽提劑,80℃水浴浸泡)除去米糠油等脂溶性物質(zhì),當(dāng)虹吸管中石油醚提取液無(wú)色時(shí),減壓過(guò)濾,取濾渣并將殘留在其中的石油醚揮盡。再用不同濃度的乙醇溶液作為溶劑提前浸泡稻殼24h,備用。

2.3 提取條件的正交設(shè)計(jì)

為全面考察微波提取法的工藝參數(shù)及最佳操作條件,按照正交表L9(34)安排四因素三水平的正交試驗(yàn),如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素水平表

2.4 稻殼中提取黃酮的工藝流程

原料的預(yù)處理→稱取40g干燥粉末→浸提劑浸泡24h→微波法提取→冷卻→抽濾→濃縮→棕色容量瓶定容→避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 提取物的精制

采用萃取法對(duì)提取物進(jìn)行精制。將提取液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至1/3后將濾液在80℃水浴上蒸干,所得固體加入水10mL溶解,再加入三氯甲烷10mL,振搖,轉(zhuǎn)入分液漏斗,靜置分層,棄去三氯甲烷層,水溶液再加入三氯甲烷10mL(重復(fù)1次),將水層減壓蒸餾,濃縮,水浴蒸至近干,干燥得精制品,備用。

2.6 提取物的定性檢驗(yàn)

采用顯色法進(jìn)行黃酮的定性檢驗(yàn)。稱取一定量的精制品,溶于80%乙醇配成濃度為5%的溶液。利用鹽酸-鎂粉,4%NaOH溶液及1%FeCl3溶液的顯色反應(yīng),觀察其顏色變化。

2.7 Fenton反應(yīng)法[5]測(cè)定稻殼中總黃酮的抗氧化能力

取5支帶塞的試管,依次編號(hào)。每支試管分別加入9mmol/L的FeSO4溶液1mL,9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2mL,按試管編號(hào)各加入不同濃度的黃酮水溶液2mL,最后加入8.8mmol/L的H2O2溶液2mL進(jìn)行反應(yīng),放于在37℃下水浴條件下反應(yīng)1h,以蒸餾水代替黃酮水溶液作空白對(duì)照,在510nm處測(cè)定樣品的吸光度,記錄數(shù)據(jù)。其清除自由基的清除率可用公式表示如下:

式中:AS為加入提取液后的吸光度;A 0為空白對(duì)照液的吸光度;A為溶液本身的吸光度。

2.8 稻殼中黃酮類化合物在豬油中的抗氧化作用

采用烘箱儲(chǔ)藏法測(cè)定提取物對(duì)豬油自氧化的抗氧化能力。豬油由市售板油在燒杯中用文火熬煉而成。稱取粗黃酮粉0.05、0.10、0.20g,各用5mL濃度為60%乙醇溶解后分別加到20.00g溫?zé)嶝i油中,攪勻,以不加稻殼黃酮粉,僅在20.00g豬油中加入60%乙醇5mL為對(duì)照樣,在(65±1)℃烘箱中強(qiáng)化保存,每隔2d取樣測(cè)定豬油中的過(guò)氧化值(POV值),并以此來(lái)表示豬油的氧化速度,進(jìn)而衡量稻殼中黃酮類化合物的抗氧化活性。樣品的過(guò)氧化值(POV)計(jì)算:

式中:POV為樣品的過(guò)氧化值,mmol/kg;V 1為試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V 2為空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;N為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度,mol/L;0.1269為1mg硫代硫酸鈉相當(dāng)?shù)獾目藬?shù);W 為試樣的質(zhì)量,g。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:y=5.5045x+ 0.0053(r= 0.9974)

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

微波法提取稻殼中的黃酮類化合物的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示,各種因素對(duì)黃酮提取量影響的主次順序?yàn)?微波時(shí)間＞乙醇濃度＞微波功率＞固液比,最佳的提取條件為乙醇濃度70%,提取時(shí)間120s,固液比1g¨10mL,微波功率為高火(700 W),即A 3B2C2D3。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出該條件下黃酮類化合物的提取率為0.313%。

表2 微波法提取黃酮類化合物正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 提取物的定性檢驗(yàn)結(jié)果

稻殼提取物與鹽酸-鎂粉反應(yīng)產(chǎn)生橙色泡沫;與NaOH反應(yīng),溶液變黃色;與FeCl3反應(yīng),生成墨綠色溶液。表明稻殼提取物中可能含有黃酮類、黃酮醇類、雙氫黃酮類等多種黃酮類化合物。

3.4 抗氧化活性研究

3.4.1 稻殼中黃酮化合物清除羥基自由基的活性

黃酮類化合物可作為金屬離子螯合劑,阻斷Fenton反應(yīng)系統(tǒng)中自由基的生成。按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度,并計(jì)算清除率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 稻殼中黃酮類化合物對(duì)羥基自由基的清除率

由表3可以看出,稻殼中總黃酮提取液對(duì)由Fenton體系產(chǎn)生的·OH有一定的清除作用,隨著總黃酮提取液濃度的增加,對(duì)自由基(·OH)的清除能力也增強(qiáng).當(dāng)提取液濃度達(dá)到1.5%時(shí),提取液對(duì)羥自由基的清除作用達(dá)到最大。

3.4.2 POV值測(cè)定法

不同濃度的樣品POV值隨時(shí)間變化情況如表3?？梢钥闯?相對(duì)于對(duì)照樣,在豬油中添加不同質(zhì)量的黃酮粉,均可顯著抑制豬油的自動(dòng)氧化,表現(xiàn)比較強(qiáng)的抗氧化性。而且隨著添加量的增加,抗氧化能力也隨之增強(qiáng)?？傮w來(lái)看,添加量越大抗氧化效果越好。

表4 稻殼中黃酮類化合物對(duì)豬油的抗氧化作用

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定了微波法提取稻殼中黃酮類化合物的最佳提取條件:乙醇濃度70%,提取時(shí)間120s,固液比1g¨10mL,微波功率700 W?？寡趸缘难芯勘砻鞯練ぶ悬S酮類化合物具有較強(qiáng)的清除自由基能力和顯著的抗豬油過(guò)氧化作用,且在一定濃度范圍內(nèi),稻殼黃酮類化合物濃度越大,其抗氧化性越強(qiáng)。

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1008-0104(2011)06-0083-02

2011-09-20)

佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目,編號(hào):Dz2011-057。

張羽男(1979～)男,黑龍江佳木斯人,博士,講師,研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。