李揚，李妍，劉艷，袁棟棟，張列兵，楊瑞學

（1.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)機械化科學研究院，北京 100083）

不同處理對Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus LB細胞膜脂肪酸的影響

李揚1，李妍1，劉艷1，袁棟棟1，張列兵1，楊瑞學2

（1.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)機械化科學研究院，北京 100083）

研究了pH值為6.0（溫度為32，37，42和42℃），pH值為5.0和5.5五種培養(yǎng)條件、兩個不同生長階段對Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus LB細胞膜脂肪酸組成的影響，以及冷凍干燥過程中細胞膜脂肪酸組成的變化。實驗菌株Lb.LB中主要檢測到8種脂肪酸。不同處理條件下Lb.LB細胞膜脂肪酸種類一樣，但質(zhì)量分數(shù)存在差異。C12：0和C19cyc9質(zhì)量分數(shù)差異最大，變化范圍分別為0.86%～2.16%和4.03%～7.51%。冷凍干燥過程中Lb.LB細胞膜中各脂肪酸質(zhì)量分數(shù)變化甚微。

德氏乳桿菌保加利亞亞種；細胞膜；脂肪酸；冷凍干燥

0 引 言

德氏乳桿菌保加利亞亞種 （Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus）是酸奶生產(chǎn)中常用菌種之一，經(jīng)凍干后以干粉形式存在，可直接用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)。

在較低的溫度和pH值下培養(yǎng)時，乳酸菌細胞的凍干耐受性較高[1，2]；且處于穩(wěn)定期不同階段的乳酸菌細胞，其對凍干的耐受性也不相同[3]。Wang Yu等認為調(diào)節(jié)細胞膜脂肪酸組成是乳酸菌細胞在脅迫 （stress）環(huán)境下自我保護的首選措施[4]。細胞膜中不飽和脂肪酸含量較高時，細胞凍干耐受性較好[5-7]。因此，研究不同條件培養(yǎng)及穩(wěn)定期不同階段對乳酸菌細胞膜脂肪酸組成的影響，可以為改善乳酸菌凍干存活率提供一定的理論參考。本文針對這一問題展開研究，并進一步探討了不同條件培養(yǎng)的Lb.LB細胞在冷凍干燥過程中膜脂肪酸組成的變化。

1 實 驗

1.1 材料

菌種：德氏乳桿菌保加利亞亞種 （Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus LB，Lb.LB），實驗室保藏菌種。

MRS液體和固體培養(yǎng)基[8]：121℃，15 min滅菌，分別用于菌種活化和活菌計數(shù)。

改良MRS培養(yǎng)基：121℃，15 min滅菌，用于菌體培養(yǎng)，實驗室改良配方。

菌種保藏：懸浮于滅菌（115℃，15 min）的10%脫脂乳（含1%谷氨酸鈉）中，于-40℃冰箱凍存，每次使用前活化。

菌種活化：取原始菌種以質(zhì)量分數(shù)為1%接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，再以質(zhì)量分數(shù)為1%的接種量連續(xù)傳代兩次后，以質(zhì)量分數(shù)為2%接種量接種至改良MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 主要設(shè)備

BIOTECH-5BGZA自動發(fā)酵罐 （上海保興）、TGL-20M冷凍離心機 （長沙平凡）、LGJ-10D冷凍干燥機（北京四環(huán)）。

1.3 方法

1.2.1 不同條件下Lb.LB的培養(yǎng)

采用5 L全自動發(fā)酵罐于pH值為6.0（溫度為32，37，42和42℃），pH值為5.0和5.5培養(yǎng)Lb.LB，取對數(shù)期末穩(wěn)定期初期懸液，3 000 g，15 min離心；按菌泥︰保護劑（質(zhì)量濃度比）=1︰（5～6）比例添加保護劑。-80℃預凍13 h，真空干燥24 h，冷阱溫度≤55℃，真空度1.0 Pa。

1.2.2 活菌數(shù)測定

采用平板計數(shù)法，37℃，MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～72 h后計數(shù)。

1.2.3 細胞膜脂肪酸的測定

（1）細胞膜脂肪酸的提取。

分別取預凍前、預凍后干燥前、干燥后菌液2 mL，5 000 g，10 min離心，菌體細胞用相同體積的無菌水洗滌兩次。在Rozes脂肪酸提取方法的基礎(chǔ)上略作改動[9，10]，即上述菌泥中加入1 mL濃度為1 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液，劇烈振蕩1 min，加入1.8 mL正己烷溶液，振蕩20 s，2000 g，5 min離心后，取上清，-40℃冰箱密封保存待測。

（2）氣質(zhì)條件。

使用氣質(zhì)聯(lián)儀分析Lb.LB細胞膜脂肪酸組成，毛細管柱為HP-5MS，0.25 mm×30 m×0.25 μm，載氣為高純氦氣，進樣量1 μL，不分流進樣。

進樣口溫度250℃，柱流速1 mL/min，柱起始溫度60℃，保持1 min，以8℃/min升至200℃，保持2 min，再以15℃/min升至280℃，保持4 min。

質(zhì)譜條件：用電子轟擊源（EI）分析，電子能量70 eV。

1.2.4 脂肪酸質(zhì)量分數(shù)計算

Lb.LB菌株細胞膜脂肪酸峰面積總和認為是100%，根據(jù)每種脂肪酸峰面積占總峰面積的比例計算脂肪酸的相對質(zhì)量分數(shù)，即

某種脂肪酸質(zhì)量分數(shù)=某脂肪酸峰面積/脂肪酸峰面積總和×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文中脂肪酸數(shù)據(jù)為兩次平行實驗的平均值。實驗使用spss17.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

實驗菌株保加利亞乳桿菌Lb.LB細胞膜中主要檢測到八種脂肪酸，分別為十二烷酸（C12：0）、十四烷酸（C14：0），十六烯酸（C16：1），十六烷酸（C16：0），十八烯酸（C18：1），十八烷酸（C18：0），十八碳二烯酸（C18：2），dihydrosterculic（9,10-methyleneoctadecanoic，C19cyc9），這些脂肪酸都是乳酸菌細胞膜中常見的脂肪酸[11-13]。

2.1 不同培養(yǎng)條件下Lb.LB細胞膜脂肪酸組成

培養(yǎng)溫度對Lb.LB細胞膜脂肪酸組成的影響較大（表1）。 除C14：0和C16：1外，3種不同溫度培養(yǎng)的Lb.LB細胞膜中其他6種脂肪酸含量均發(fā)生了明顯變化 （P＜0.05），并且不同脂肪酸隨溫度的變化規(guī)律不同。C12︰0在32℃培養(yǎng)的Lb.LB細胞膜中的質(zhì)量分數(shù)顯著高于另2種溫度。C16︰0和C18︰1在37℃培養(yǎng)Lb.LB細胞膜中質(zhì)量分數(shù)最高，在42℃培養(yǎng)時質(zhì)量分數(shù)最低；而C18︰0和C18︰2則正相反，在37℃培養(yǎng)的Lb.LB細胞膜質(zhì)量分數(shù)最低，在42℃培養(yǎng)時質(zhì)量分數(shù)最高；C19cyc9在37℃培養(yǎng)的Lb.LB細胞膜中質(zhì)量分數(shù)最高，42℃培養(yǎng)次之，32℃培養(yǎng)時質(zhì)量分數(shù)最低。

表1 不同溫度培養(yǎng)時Lb.LB細胞膜脂肪酸的組成

不同pH值培養(yǎng)對Lb.LB細胞膜脂肪酸質(zhì)量分數(shù)也有顯著影響（見表2），除C16︰0和C18︰1之外，其他細胞膜脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)都因pH值的變化而發(fā)生顯著變化（P＜0.05）。C19cyc9質(zhì)量分數(shù)隨著pH值的升高而增加，其他脂肪酸隨pH值變化沒有明顯規(guī)律。C12︰0在pH值為5.5培養(yǎng)的Lb.LB細胞膜中質(zhì)量分數(shù)最高，而pH值為6.0培養(yǎng)時質(zhì)量分數(shù)最低。C14︰0和C18︰0在pH值為5.0培養(yǎng)的Lb.LB細胞膜中質(zhì)量分數(shù)最高，在pH值為5.5培養(yǎng)時質(zhì)量分數(shù)最低；而C16：1、C18：2在pH5.0培養(yǎng)的Lb.LB細胞膜中質(zhì)量分數(shù)最低，在pH5.5培養(yǎng)時含量最高。

表2 不同pH培養(yǎng)時Lb.LB細胞膜脂肪酸的組成

2.2 不同生長階段Lb.LB細胞膜脂肪酸組成

乳酸菌增殖培養(yǎng)通常在菌體生長的穩(wěn)定期收獲菌體，并進一步處理制備凍干發(fā)酵劑[14-16]。本研究針對穩(wěn)定期不同階段Lb.LB細胞膜脂肪酸組成的變化進行分析，結(jié)果如表3所示。穩(wěn)定期初期與中期收獲的Lb.LB細胞膜脂肪酸含量無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 凍干中Lb.LB細胞膜脂肪酸組成的變化

結(jié)果表明，與培養(yǎng)過程相比，在冷凍干燥過程中Lb.LB細胞膜脂肪酸種類無變化，但某些脂肪酸含量發(fā)生了一定變化，并且這種變化因菌株的培養(yǎng)溫度和pH值條件的不同而不同，如圖1和圖2所示。

表3 不同生長階段Lb.LB細胞膜脂肪酸的組成

圖1中，pH值控制在6.0，從上至下3個培養(yǎng)溫度依次為32，37，42℃。

圖2中，溫度控制在42℃，從上至下3個培養(yǎng)pH值依次為5.0，5.5，6.0。

由圖1和圖2可以看出，在32，37，42℃培養(yǎng)的菌株經(jīng)凍干后細胞膜中C18︰2，C19cyc9和C18︰0質(zhì)量分數(shù)分別有所增加，統(tǒng)計學差異顯著（P＜0.05），其他脂肪酸質(zhì)量分數(shù)無顯著變化。pH值為5.0培養(yǎng)，細胞膜脂肪酸組成無顯著變化（P＞0.05）。pH值為5.5培養(yǎng)，預凍后C18︰0質(zhì)量分數(shù)增加，凍干后C19cyc9質(zhì)量分數(shù)增加，差異顯著（P＜0.05），其他脂肪酸質(zhì)量分數(shù)無顯著差異。

3 討 論

3.1 不同培養(yǎng)條件對Lb.LB的影響

有研究結(jié)果表明，微生物細胞處于不同環(huán)境中，其細胞膜脂肪酸組成不同[17]。從本文實驗結(jié)果來看，不同溫度和pH培養(yǎng)下Lb.LB細胞膜脂肪酸的含量不同，但其含量變化與培養(yǎng)溫度和pH無線性關(guān)系。本實驗中在32℃和37℃培養(yǎng)下Lb.LB細胞膜不飽和脂肪酸C16：1和C18：1的含量高于42℃培養(yǎng)，而C18：2質(zhì)量分數(shù)低于42℃培養(yǎng)；pH6.0培養(yǎng)下Lb.LB細胞膜C19cyc9的含量高于5.0培養(yǎng)，這與Li Chun等報道的結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)pH值控制在6.0時，較低溫度（30℃）培養(yǎng)下Lactobacillus bulgaricus L2細胞膜中C16：1和C18：1質(zhì)量分數(shù)高于較高溫度（39℃）培養(yǎng)，而C18：2含量略低于較高溫度培養(yǎng)。當培養(yǎng)溫度控制在39℃時，pH值為6.0培養(yǎng)下其細胞膜中cycC19：0質(zhì)量分數(shù)高于pH值為5.0培養(yǎng)[12]。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在較低溫度（32℃）培養(yǎng)下Lb.LB細胞膜C12：0的質(zhì)量分數(shù)較高，可能與Lb.LB細胞在較低溫度下的自我調(diào)節(jié)有關(guān)，Chiara Montanari等發(fā)現(xiàn)L.sanfranciscensis細胞在低溫下可通過減短膜脂肪酸碳鏈鏈長，增加短鏈脂肪酸（C12：0）的質(zhì)量分數(shù)以維持細胞膜正常的生理功能[18]。

3.2 不同生長階段對Lb.LB的影響

有研究證實，不同生長階段的微生物細胞膜脂肪酸的組成不同，且不同種屬微生物之間，這種脂肪酸組成的變化也不相同[16]。但多數(shù)報道都認為不同生長階段細胞凍干存活率的差異和細胞膜脂肪酸組成有關(guān)[16，17]。在本研究中，Lb.LB在穩(wěn)定期初期和穩(wěn)定期中期細胞膜脂肪酸組成無顯著差異（P＞0.05），這可能是由于研究所用菌株與之前文獻報道的不同，或者所取的樣本都處于穩(wěn)定期內(nèi)的原因所致。然而，分別在這兩個階段收集的Lb.LB菌體細胞經(jīng)冷凍干燥后的存活率卻明顯不同（數(shù)據(jù)未給出），這說明除細胞膜脂肪酸之外，可能還有其他因素影響菌體細胞在冷凍干燥過程中的存活。

3.3 Lb.LB在冷凍干燥過程中的變化

關(guān)于保加利亞乳桿菌凍干過程中細胞膜脂肪酸組成變化的研究較少，本研究分析了不同培養(yǎng)條件下Lb.LB在凍干中細胞膜脂肪酸質(zhì)量分數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)凍干中多數(shù)細胞膜脂肪酸質(zhì)量分數(shù)未發(fā)生變化，只有少數(shù)樣本的脂肪酸含量增加，幅度也不大。溫度為32℃（pH值為6.0）和溫度37℃（pH值為6.0），溫度為42℃（pH值為5.5）培養(yǎng)下Lb.LB細胞凍干后細胞膜中C18︰2和C19cyc9質(zhì)量分數(shù)分別增加，這可能與Lb.LB菌體細胞膜在凍干脅迫條件下的自我調(diào)節(jié)有關(guān)。有研究認為，微生物細胞面對環(huán)境脅迫時，會通過細胞膜脂肪酸的去飽和、形成分支、減短碳鏈鏈長或形成環(huán)丙烷脂肪酸來維持細胞膜正常的生理功能[12、19-21]。在不飽和和環(huán)狀脂肪酸質(zhì)量分數(shù)增加同時，我們發(fā)現(xiàn)42℃，pH值為6.0培養(yǎng)Lb.LB細胞凍干后飽和脂肪酸C14︰0和C18︰0質(zhì)量分數(shù)也有所增加，Castro等研究也發(fā)現(xiàn)37℃培養(yǎng)Lactobacillus bulgaricus凍干后細胞膜飽和脂肪酸含量增加[9]，其原因目前還不清楚。

4 結(jié) 論

當溫度為30～42℃和pH值為5.0～5.5波動時，Lb.LB細胞膜脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)變化明顯，培養(yǎng)溫度對Lb.LB細胞膜脂肪酸質(zhì)量分數(shù)的影響比培養(yǎng)pH值大，其中，C12：0和C19cyc9質(zhì)量分數(shù)差異最大，變化范圍分別為0.86%～2.16%和4.03%～7.51%。兩個不同生長階段（穩(wěn)定期初期與穩(wěn)定期中期）Lb.LB細胞膜脂肪酸的組成無顯著差異。在實驗選擇的凍干工藝下，不同條件培養(yǎng)的Lb.LB在冷凍干燥過程中細胞膜脂肪酸組成的變化不相同，且變化甚微。凍干中細胞的自我調(diào)節(jié)機制還不明確，需要進一步研究。

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Effects of different disposes on compositions of membrane fatty acids of Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus LB

LI Yang1,LI Yan1,LIU Yan1,YUAN Dong-dong1,ZHANG Lie-bing1,YANG Rui-xue2
（1.College of Food Science&Natritional Engineening,China Agricultural University,Beijing 100083,China;
2.Chinese Acadency of Agricultural Mechanization Science,Beijing 100083,China）

At pH=6.0,32，37，42 and 42℃,pH=5.0、5.5,the effects of different cultivating temperature,pH and stages on compositions of membrane fatty acids of Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus LB were studied.The changes of membrane fatty acids during freeze-drying were also studied.In different conditions the kinds of fatty acids retained the same,while the content of fatty acids differed from each other,especially the C12：0 and C19cyc9.The content of C12：0 and C19cyc9 ranged from 0.86%to 2.16%and from 4.03%to 7.51%,respectively.Almost,no significant changes of the content of fatty acids had been discovered during freeze-drying.

Lb.delbrueckii subsp.Bulgaricus；membrane；fatty acid；freeze-drying

Q93-33

A

1001-2230（2011）08-0004-04

2011-04-27

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（CARS-37）。

李揚（1986-），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學。

張列兵