吳文曄 徐 煒 李 艷 舒文祥 周 堅

（無錫安迪生物工程有限公司，無錫 214174）

·食品分析·

同時檢測兩種真菌毒素的膠體金試紙條的研制*

吳文曄**徐 煒 李 艷 舒文祥 周 堅

（無錫安迪生物工程有限公司，無錫 214174）

目的：研究制備同時檢測黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）和赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OA）兩種真菌毒素的膠體金快速檢測卡。方法：以人工合成抗原OVA-AFB1、OVA-OA和抗AFB1單克隆抗體、抗OA單克隆抗體為原料，用硝酸纖維膜和玻璃纖維紙作為載體，制作出同時檢測AFB1和OA的膠體金快速檢測卡。結果：該檢測卡能同時檢測AFB1和OA兩種真菌毒素，且兩者之間互不干擾，靈敏度均可達到2.5 μg/L，重復性、穩(wěn)定性均良好。結論：成功制作出了能同時檢測兩種真菌毒素的快速檢測卡，一次操作能檢測兩種毒素，節(jié)省了檢測時間和檢測成本。

黃曲霉毒素B1；赭曲霉毒素A；單克隆抗體；膠體金

黃曲霉毒素（AFT） 是一類由黃曲霉菌和寄生曲霉菌中產毒菌株產生的代謝產物，均具有雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮的結構，是世界衛(wèi)生組織公認的致癌物。其中以B1的毒性和致癌性最強，M1、G1次之，B2、G2較弱。研究證實AFT具有極強的毒性和致癌性，其主要是損害動物肝臟，引發(fā)動物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等；其次是具有細胞毒作用,并抑制機體的免疫機能。

赭曲霉毒素A（OA）是曲霉菌和青霉屬等產毒菌株產生的一組結構類似的有毒代謝產物，是一種對肝臟和腎臟的強毒物質，可以導致受試動物的免疫抑制、腎萎縮、胎兒畸形、流產及死亡，并具有高度的致癌、致畸、致突變作用。這兩種毒素均可通過食物鏈在生物體之間轉移，因而不僅給農民和家禽、家畜生產者造成經濟上的損失，而且污染食品也對人類健康構成威脅。

目前已建立的AFB1、OA 檢測方法有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、免疫親和柱熒光光度法（IAC）、酶聯吸附法（ELISA）、金標法（GICA） 等。TLC、HPLC、IAC這些方法具有檢測準確可靠、靈敏度高和重復性好等特點，但是要求對樣品進行較繁瑣前處理，需要昂貴的儀器并耗費大量人力，因此無法進行大范圍推廣。ELISA具有操作相對簡單、靈敏度高等優(yōu)點，但也存在需要專門儀器和耗時較長等缺點。相比之下，金標法（GICA）具有簡單快速、適合現場檢測等優(yōu)點。目前有利用膠體金免疫層析方法單獨檢測AFB1或OA相關方面的研究，本文主要針對能夠同時檢測AFB1和OA兩種真菌毒素的膠體金快速檢測卡進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標準品、赭曲霉毒素A標準品：純度≥98.0 g/100g，Sigma公司；OVA-AFB1抗原、OVA-OA完全抗原、抗AFB1單克隆抗體、抗OA單克隆抗體：無錫安迪生物工程有限公司自制；羊抗鼠IgG：杭州隆基生物技術有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維、樣品墊、吸水紙：上海金標生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、聚乙二醇、氯金酸、檸檬酸三鈉、吐溫-20：均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；漩渦振蕩器SK-1、99-1A大功率數顯恒溫磁力攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；雙光束紫外可見分光光度計：上海黃河儀表廠；點膜機、切條機：美國Bio-dot。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備

用容量瓶量取200 mL超純水加入到500 mL錐形瓶中，將錐形瓶置于加熱板上，放入磁力攪拌器，打開攪拌旋鈕至適當速度。用移液器吸取2 mL質量分數1%的氯金酸溶液于上述200 mL超純水中，攪拌1 min，關閉攪拌旋鈕，打開加熱旋鈕，加熱至沸騰。打開攪拌旋鈕至適當速度，快速加入經微孔濾膜過濾的質量分數1%的檸檬酸三鈉溶液0.8 mL，溶液在2 min內由灰色變成黑色最后變成紅色，再繼續(xù)加熱攪拌10 min。關掉加熱旋鈕，適當速度攪拌至室溫，定容到200 mL，4℃保存。

量取30 mL膠體金置于50 mL的小燒杯中，用0.1 mol/L K2CO3溶液調pH為8，磁力攪拌器攪拌均勻，同時加入300 μg抗AFB1單克隆抗體（制備OA的金標抗體時為加入300 μg抗OA單克隆抗體）繼續(xù)攪拌20 min；緩慢加入質量分數10%的BSA至其終質量分數為1%，繼續(xù)攪拌30 min，4℃冰箱靜置2 h；將上述膠體金溶液轉入50 mL離心管中，以8 000 r/min離心30 min，小心吸去上清液，沉淀放入4℃冰箱中備用。

沉淀適當稀釋后用點膜機在玻璃纖維上噴金標抗體，10 μL/cm，37℃干燥2 h以上。硝酸纖維膜上由上至下依次噴涂：（1）羊抗鼠IgG（1 mg/mL），此為質控線；（2）OVA-OA完全抗原（1 mg/mL，0.01 mol/L pH7.4的CBS稀釋），此為檢測OA的檢測線 T1；（3）OVA-AFB1完全抗原 （1 mg/mL，0.01 mol/L pH7.4的CBS稀釋），此為檢測AFB1的檢測線T2，噴量均為1 μL/cm，37℃干燥30 min以上。將NC膜、膠體金墊、樣品墊和吸水紙依次組裝在底板上，用切刀切割成3.95 mm寬的試紙條裝入檢測卡中。

1.3.2 膠體金免疫層析快速檢測試紙條的質量評價

1.3.2.1 試紙條的靈敏度試驗

在加樣孔中加入75 μL樣品液，10 min后觀察結果。用試紙條測定質量濃度分別為0 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的AFB1和OA標準品, 每個濃度重復6次，根據試驗結果判斷其敏感性。

1.3.2.2 試紙條的精密度試驗

取不同批經檢驗合格的飼料、花生、玉米樣品各四份，粉碎后，每份樣品加入10 mL樣品抽提液，充分攪拌混合（至少5 min），震蕩反應30 min。4 000 r/min離心10 min，取上清，加入一定量的AFB1標準品，使得樣品抽提液中AFB1的終質量濃度分別為 1.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L 和10.0 μg/L，用不同批次的6批真菌毒素二聯檢測卡，分別在6 d對這些樣品進行檢測，每個濃度設6個重復，檢驗其重復性。

同理制備 OA 質量濃度為 1.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L和10.0 μg/L的飼料樣、花生樣、玉米樣進行重復性試驗，步驟同上。

1.3.2.3 試紙條的穩(wěn)定性試驗

試紙條和干燥劑一起用鋁箔袋密閉包裝，分別置4℃、室溫和37℃保存。4℃和室溫保存的試紙條每周各取出6條，分別用0μg/L標準品和2.5μg/L的AFB1和OA的標準品溶液檢測試紙條，觀察檢測線顏色的深淺以及NC膜上金標抗體釋放程度。37℃保存的試紙條每天取出6條，用0 μg/L標準品和2.5 μg/L的AFB1和OA的標準品溶液檢測試紙條，觀察檢測線顏色的深淺以及NC膜上金標抗體釋放程度。

2 結果與分析

2.1 試紙條的靈敏度

檢測卡內試紙條的主要反應是免疫學的抗原和抗體反應，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標記的抗體，分別與測試帶上的人工合成抗原OVA-AFB1、OVA-OA，以及質控帶上羊抗鼠二抗反應，形成棕紅色條帶。若樣品中有相應的待檢AFB1和OA都高于允許值，當樣品加入后即與相應的抗體發(fā)生反應，而不會與相應的檢測帶所含的人工合成抗原OVA-AFB1、OVA-OA反應，從而不顯色。靈敏度試驗結果見圖1、圖2。

圖1 真菌毒素二聯檢測卡對AFB1的靈敏度

從圖 1 （序號 1～7 分別表示 0 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的AFB1標準品溶液）可見，AFB1陰性時，真菌毒素二聯檢測卡相應的檢測線出現明顯的紅色條帶；隨著AFB1標準品濃度的增加，檢測線T2條帶逐漸減弱，當質量濃度增至2.5 μg/L時，檢測線T2無紅色條帶出現，質控線C和檢測線T1出現深紅色條帶。由此判斷該檢測卡對AFB1的靈敏度為2.5μg/L。

圖2 真菌毒素二聯檢測卡對OA的靈敏度

從圖 2 （序號 1～7 分別表示 0 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的OA標準品溶液）可見，OA陰性時，真菌毒素二聯檢測卡相應的檢測線出現明顯的紅色條帶；隨著OA標準品濃度的增加，檢測線T1條帶逐漸減弱，當質量濃度增至2.5 μg/L時，檢測線T1無紅色條帶出現，質控線C和檢測線T2出現深紅色條帶。由此判斷該檢測卡對OA的靈敏度也為2.5 μg/L。且AFB1和OA兩者之間互不干擾。

2.2 試紙條的精密度

試紙條精密度試驗結果見下頁表1、表2。由表1、表2可知，不同批次的6批真菌毒素二聯檢測卡對飼料樣、花生樣、玉米樣的檢測結果完全一致，證明不同批次生產的真菌毒素二聯檢測卡檢測結果穩(wěn)定可靠，具有良好的重復性。

2.3 試紙條的穩(wěn)定性

試紙條在37℃條件下保存到14 d、在4℃保存14個月和室溫保存1 a，檢測0 μg/L標準品質控線和檢測線顯色仍很清晰，結合墊上金標記物釋放完全；檢測2.5 μg/L標準品時質控線顯色清晰，檢測線完全抑制，能滿足正常檢測要求。最后確定試紙條密封干燥下4℃至少可保存14個月，室溫條件下可保存1 a。

3 結論

GB2761-2011《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，AFB1在玉米、花生、花生油、玉米油中的限量標準為20 μg/kg，在稻谷、植物油脂中的限量標準為10 μg/kg，在小麥、豆類、堅果中的限量標準為5 μg/kg。OA在谷物、豆類中的限量標準為 5 μg/kg。

本檢測卡把靈敏度確定為2.5 μg/L。由于真菌毒素二聯檢測卡是采用競爭原理設計的，因此膠體金標記抗體量尤為關鍵，標記抗體量過多，靈敏度就會降低，達不到應用價值；而標記抗體量過少，盡管能提高靈敏度，但會使陰性顯色條帶較淡，不易與陽性進行比較。本試驗中采用不同的抗體標記量和不同的抗原包被量之間進行正交試驗，從而確定最佳的標記量和包被量，使得真菌毒素二聯檢測卡對AFB1和OA的最低檢測限均能達到2.5 μg/L。

表1 不同批次檢測試紙對AFB1的精密度試驗（n=6）μg/L

表2 不同批次檢測試紙對OA的精密度試驗（n=6）

將兩項毒素指標集成在一個試紙條上，首先要保證兩者之間沒有干擾性，從AFB1和OA兩者的化學結構來看（見圖3、圖4），兩者差異很大，這就保證了他們各自的抗原和抗體能特異性地結合，而不會對另一方產生干擾。

圖3 曲霉毒素B1結構圖

圖4 曲霉毒素A結構圖

本試驗成功將兩項毒素檢測集合在一個試紙條上，一次操作即能檢測兩種真菌毒素，即節(jié)省了檢測成本，又降低了檢測的勞動強度，且靈敏度高、特異性好，具有很好的經濟價值和社會價值。

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Developing gold immunochromatography assay for simultaneously rapid detection ofaflatoxin B1 and ochratoxin A

WUWen-ye**XUWeiLI YanSHUWen-xiangZHOUJian
（Wuxi antixbiotech company，Wuxi 214174，China）

Objective：To develop gold immunochromatography assay for simultaneously rapid detection of aflatoxin B1（AFB1） and ochratoxinA（OA）.Methods：Synthetic antigen OVA-AFB1，OVA-OA and anti-AFB1monoclonal antibody,anti-OA monoclonal antibody were used as raw material，nitrocellulose membrane and glass fiber paper as a carrier to produce a mycotoxins test strip which can detect AFB1and OA.Results：The results showed that the test strip can simultaneously detect AFB1and OA,and there's no interference AFB1and OA，the sensitivity of the test strip can reach 2.5 μg/L.Conclusion：A mycotoxins test strip which can simultaneously detect two kinds of fungi toxins was successfully produced,which was featured with one operation could detect both toxins to save test time and cost.

aflatoxinB1； ochratoxinA； monoclonal antibody； colloidal gold；test strip

TS261.1+2

A

1673-6004（2011）04-0052-02

國家科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金（10c262132 01075）

**吳文曄，女，1984年出生，2008年畢業(yè)于江南大學微生物與生化藥學專業(yè)，碩士。

2011-09-30