羅艷蕊,梅 濤,孫景權(quán)
●博士(生)論壇
茶多酚及耐力訓練對高脂膳食大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)和Bax、Bcl-2表達的影響
羅艷蕊1,梅 濤1,孫景權(quán)2
目的:觀察茶多酚及耐力訓練對高脂膳食大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)及Bax、Bcl-2表達的影響。方法:雄性SD大鼠64只,隨機分為安靜對照組(A)、安靜高脂膳食組(B)、安靜高脂膳食茶多酚低組(C)、安靜高脂膳食茶多酚高組(D)、耐力訓練對照組(E)、耐力訓練高脂膳食組(F)、耐力訓練高脂膳食茶多酚低組(G)、耐力訓練高脂膳食茶多酚高組(H),每組8只。C、G組茶多酚灌胃劑量為150 mg/kg體重,D、H組劑量為300 mg/kg體重,其他組灌服同等體積的蒸餾水。耐力訓練組每天游泳60 min,一周6天,訓練6周。結(jié)果:B組大鼠心肌纖維粗糙,心肌間空白區(qū)域增多;C和D組心肌結(jié)構(gòu)得到改善,心肌間空白面積減少;各耐力訓練組大鼠心肌纖維致密。與A組比較,B組大鼠心肌細胞Bax表達顯著提高,Bax/Bcl-2比值增大;C和D組Bax表達水平下降,Bax/Bcl-2比值減?。籉組大鼠心肌細胞Bax/Bcl-2比值低于B組,G和H組大鼠心肌細胞Bax表達量恢復至A組水平,Bax/Bcl-2比值顯著低于B組。結(jié)論:高脂膳食導致大鼠心肌正常形態(tài)喪失,心肌細胞凋亡增加,但這種心肌損傷可分別經(jīng)茶多酚補充和耐力訓練改善,且長時間耐力訓練與茶多酚對高脂膳食導致的心臟損傷程度具有協(xié)同改善效應。
茶多酚;耐力訓練;高脂膳食;心??;Bax;Bcl-2
隨著人類生活水平的提高,肥胖人群的比例在不斷提高,尤其是青少年。由肥胖而引發(fā)的心血管系統(tǒng)疾病正在嚴重威脅著人類的健康,1997年世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將肥胖列為僅次于吸煙和艾滋病的第三大嚴重危害人類健康的慢性殺手。
健康雄性SD大鼠(SCXK(豫)2005-0001)由河南省實驗動物中心提供,清潔級,體重180~220 g。高脂膳食總熱量4.23 Mcal/kg,其中脂肪40%、蛋白質(zhì)15%、碳水化合物45%,購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所;普通膳食為國家標準嚙齒類動物干燥飼料,由河南省實驗動物中心提供。實驗期間動物自由攝食、飲水,溫度(25±2)℃,濕度40%~60%,自然光照節(jié)律,分籠飼養(yǎng)。
茶多酚由杭州禾田生物公司提供,純度95%以上;Bax、Bcl-2免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;其他藥品均為分析純。
適應性飼養(yǎng)1周后,將64只大鼠隨機分為8組:安靜對照組(A)、安靜高脂膳食組(B)、安靜高脂膳食茶多酚低組(C)、安靜高脂膳食茶多酚高組(D)、耐力訓練對照組(E)、耐力訓練高脂膳食組(F)、耐力訓練高脂膳食茶多酚低組(G)、耐力訓練高脂膳食茶多酚高組(H),每組各8只。
其中安靜對照組和耐力訓練對照組飼喂普通膳食,其他6組飼喂高脂膳食。實驗期間每天稱取大鼠體重,根據(jù)當天體重于下午3∶00—5∶00對大鼠進行灌胃處理,其中茶多酚低組劑量為150 mg/kg體重,茶多酚高組劑量為300 mg/kg體重,其他灌服同等體積的蒸餾水作為對照;灌胃共持續(xù)6周。
耐力訓練組大鼠于每天晚上7∶00進行游泳訓練,游泳訓練在水桶中進行,水桶深70 cm,水溫(30±2)℃。在適應性游泳訓練后,從30 min開始,遞增負荷到60 min后,持續(xù)游泳60 min至實驗結(jié)束,一周訓練6天,休息1天,共訓練6周。訓練中密切監(jiān)控大鼠的活動,使其保持在積極的運動狀態(tài)。
于第6周的最后一天,末次補充和訓練后的第二天上午8∶00,將大鼠稱重,斷頭處死,迅速取心臟于冰溫的生理鹽水中清洗干凈,并用吸水紙吸干后稱重,求心臟系數(shù)(心臟系數(shù)=心臟重量/體重×100),觀察茶多酚及耐力訓練對大鼠心肌肥大的影響。然后用手術(shù)刀切取心尖部的組織投入4%的中性甲醛溶液中(0.1 mol/L,pH=7.4)固定24 h,常規(guī)石蠟包埋用于HE染色、免疫組化等標本制作。
1.6.1 常規(guī)HE染色 將包埋組織切片,厚度為4 μm,常規(guī)脫蠟水化后,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察心肌細胞的整體結(jié)構(gòu)。
1.6.2 免疫組織化學染色 Bax、Bcl-2測定用免疫組化法,石蠟切片脫蠟至水,3%H2O2孵育10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗3 min×3次;正常山羊血清封閉,37℃孵育15 min;滴加1∶100稀釋的一抗,4℃過夜;取出后PBS沖洗3 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔二抗37℃孵育15 min,PBS沖洗3 min×3次;滴加辣根酶標記鏈霉卵白37℃孵育15 min,PBS沖洗3 min×3次;DAB顯色,并在鏡下控制顯色程度。自來水充分沖洗、脫水、透明、封片;Olympus cover-018熒光顯微鏡觀察拍照,CIS細胞分析系統(tǒng)掃描心肌細胞Bax、Bcl-2灰度值。用PBS代替一抗做空白對照。每組選片10張,每張切片(× 400)隨機選取5個視野進行分析,灰度平均值越大,其陽性表達越小。
所有數(shù)據(jù)用SSPS11.5進行單因素方差分析,T檢驗法比較各組之間差異是否顯著,結(jié)果用平均數(shù)±標準差表示,顯著性水平為P<0.05。
心臟系數(shù)是心臟重量與體重的比值,是反映心肌肥大的重要指標[7]。表1所示為不同處理條件下大鼠的心臟系數(shù)。從表1可以看出,安靜組各處理之間大鼠心臟系數(shù)沒有明顯差異,而耐力訓練組各處理與安靜組各處理比較,心臟系數(shù)差異均顯著,而且與A組比較差異具有極顯著水平。
注:*表示與A組比較,*P<0.05,**P<0.01;#表示與B組比較,#P<0.05,##P<0.01;&表示與C組比較,&P<0.05,&&P<0.01;▲表示與D組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。
A組大鼠心肌纖維著色均勻、結(jié)構(gòu)清晰致密、核大小均勻、呈卵圓形(見圖1-A)。B組心肌纖維粗糙、心肌間空白區(qū)域明顯增多,有些細胞核細長、偶見脫落的細胞核(圖1-B)。C和D組心肌纖維結(jié)構(gòu)顯著改善,心肌間空白面積明顯減少,心肌纖維紋理清晰、致密,細胞核較規(guī)則,D組優(yōu)于C組(見圖1-C,D)。
圖1 茶多酚及耐力訓練對高脂膳食大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)的影響(HE,×400)Fig.1 Influence of tea polyphenols and endurance training on fat-rich diet rat's myocardial cell structure(HE,×400)
耐力訓練組大鼠各處理心肌纖維均比較致密、紋理清晰,細胞著色均勻、核大小相對均一。尤以H組結(jié)構(gòu)最佳(見圖1-E,F(xiàn),G,H)。表明耐力訓練及茶多酚改善了高脂膳食帶來的心肌結(jié)構(gòu)的破壞,促進了心肌的肥大及結(jié)構(gòu)的良性轉(zhuǎn)變。
安靜狀態(tài)下心肌細胞Bax的灰度值結(jié)果見表2,與A組比較,B組Bax的灰度值極顯著下降,C和D組逐漸上升,并恢復至A組水平。E和F組Bax灰度值都比A組降低,但只有E組差異極顯著,G和H組上升至與A組無顯著差異。與B組比較,G和H組心肌細胞Bax灰度值上升,且差異極顯著。耐力訓練組內(nèi)比較,G和H組心肌細胞Bax的灰度值較E組升高,且差異顯著;與F組比較,G和H組心肌細胞Bax的灰度值呈上升趨勢。表2顯示,安靜狀態(tài)下心肌細胞Bcl-2的灰度值,B組略低于A組,C和D組的變化不大,與A組比較均沒有顯著性差異。耐力訓練狀態(tài)下4組Bcl-2的灰度值與A組的差異都不顯著。耐力訓練組內(nèi)比較,各組心肌細胞Bcl-2的灰度值也沒有顯著性差異。安靜狀態(tài)下B組Bax/Bcl-2的比值與A組相比顯著降低,C和D組比值升高,D組與A組相比差異顯著;與B組比較,C和D組二者的比值顯著上升(見表2)。E和F組與A組之間沒有顯著差異。耐力訓練狀態(tài)下,G和H組Bax/Bcl-2比值雖然升高,但與E組差異不顯著。與B組比較,F(xiàn)組、G組與H組Bax/Bcl-2的比值都顯著升高。
注:*表示與A組比較,*P<0.05,**P<0.01;#表示與B組比較,#P<0.05,##P<0.01;△表示與E組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
雖然成熟的心肌細胞喪失了有絲分裂的能力,但是長時間有規(guī)律的耐力運動所導致的運動性心臟肥大已經(jīng)是不爭的事實,也有實驗表明長期有氧運動和抗阻訓練誘導了衰老大鼠的心肌肥大[7]。本實驗結(jié)果顯示高脂膳食對大鼠心臟系數(shù)沒有影響,而茶多酚處理對高脂膳食大鼠的心臟系數(shù)也沒有明顯影響。但是6周的耐力訓練誘導了大鼠的心肌肥大,無論是高脂膳食還是普通膳食以及茶多酚處理的大鼠均出現(xiàn)了顯著的心臟肥大現(xiàn)象,再次印證了長時間有規(guī)律的耐力運動對心臟的良性影響。而耐力訓練茶多酚高組的心臟系數(shù)比耐力訓練對照組的高,推測可能茶多酚在運動性心臟肥大、重塑的過程中起到了一定的促進作用,但具體的作用機制還有待進一步探討。
細胞凋亡即細胞程序化死亡,是一種由基因控制的細胞主動性死亡過程。細胞凋亡是廣泛存在于各組織細胞中的基本生物學現(xiàn)象,伴隨著一系列形態(tài)上的變化。過去認為,心肌細胞為終末分化細胞,細胞凋亡是不會發(fā)生在不具備增殖能力的成熟心肌細胞的。但是,1994年Gittlieb等證實了心肌細胞凋亡的存在[8]。
心肌細胞凋亡既受細胞外信號的調(diào)控,又受細胞內(nèi)酶的變化的影響,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)心肌細胞可通過多種途徑發(fā)生凋亡,如死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑等[9-10]。并且很多基因參與了心肌細胞凋亡的過程[11],這些特殊基因的產(chǎn)物有Bcl-2、Caspase、IGF蛋白家族及p53、Fas-Fasl系統(tǒng)等。目前普遍認為,Bcl-2蛋白家族參與的“線粒體”途徑是心肌細胞凋亡發(fā)生的主要機制[12]。
Bcl-2蛋白家族的成員很多,按其在細胞凋亡過程所起的作用可以分為兩類,促進凋亡的蛋白和抑制凋亡的蛋白。Bax亞族是促進凋亡的蛋白,分布廣泛,在很多組織器官中均可表達。Bax平時以非活性形式存在于細胞質(zhì)中,當Bax被凋亡因素激活后,從細胞質(zhì)移位到線粒體膜,形成誘導凋亡的同源或異源二聚體,促使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開,膜電位損失,活性氧及細胞色素C溢出,在apaf-1的幫助下激活caspase-9,進而激活細胞凋亡通路[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)6周的高脂膳食引起了心肌細胞Bax蛋白的表達增加,但是茶多酚補充組其表達顯著降低。
Bcl-2亞族是抑制凋亡的蛋白,Bcl-2定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上,其作用與Bax正好相反,可以抑制Bax蛋白形成同源二聚體及向線粒體膜的移動,穩(wěn)定線粒體的膜電位,直接或間接地阻斷細胞色素C的釋放等[14],起到抗凋亡的作用。本實驗中發(fā)現(xiàn)高脂膳食6周后Bcl-2蛋白的表達雖略有上升,但差異不顯著,同時茶多酚對其表達沒有顯著影響。
細胞凋亡程度的強弱不僅與Bax及Bcl-2蛋白表達的絕對量有關(guān),更決定于二者的比值。當Bax表達過度時,形成Bax同源二聚體,細胞趨向凋亡;當Bcl-2表達過度時,形成Bcl-2的同源二聚體和Bcl-2/Bax的異源二聚體,從而抑制細胞凋亡的發(fā)生[15]。
本研究結(jié)果顯示安靜狀態(tài)下高脂膳食引起B(yǎng)ax/Bcl-2的比值增大,表明心肌細胞發(fā)生一定程度的凋亡,茶多酚補充后比值顯著減小,提示茶多酚有效地減少了細胞凋亡的發(fā)生。HE染色結(jié)果也清晰地顯示高脂膳食導致心肌細胞的結(jié)構(gòu)受到一定的損傷,心肌纖維間空白面積增大,纖維粗糙。推測可能是長時間的脂肪浸潤主要促進了心肌細胞Bax蛋白的表達增強,導致通過線粒體途徑誘發(fā)了心肌細胞的凋亡增加。茶多酚補充后心肌結(jié)構(gòu)得到明顯改善,其可能的原因是茶多酚具有明顯的抑制線粒體通透改變孔道開放的作用[16],穩(wěn)定線粒體膜電位,部分抑制了高脂膳食帶來的通過線粒體途徑誘發(fā)的心肌細胞凋亡的增加,使心臟結(jié)構(gòu)趨于恢復正常。
運動作為一種特殊的刺激,在運動過程中由于血液的重新分配,使得心肌細胞處于相對缺血的狀態(tài),而運動后心肌供血相對充余,這是由于運動所引發(fā)的缺血再灌注,最終引起心肌細胞內(nèi)環(huán)境的改變,缺血和再灌注心肌都有可能發(fā)生細胞凋亡。近年來,運動所引起的心肌細胞凋亡的研究受到了越來越多的關(guān)注。首先,學者們都非常關(guān)注不同運動方式對心肌細胞凋亡帶來的影響,其結(jié)果比較一致,大都認為適宜負荷的運動訓練不會引起明顯的細胞凋亡,可引起心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)性、生理性重塑,有利于心臟功能的改善;而持續(xù)大強度運動和急性力竭運動等超負荷訓練常誘發(fā)細胞凋亡增加,引起運動性心肌微損傷[17-22]。但是李欣等也得出了相反的結(jié)論,發(fā)現(xiàn)長期有氧運動加劇了心肌細胞凋亡的產(chǎn)生。結(jié)論不同的原因可能是選擇的訓練方式和訓練時間差異所造成的[23]。孟雋卿和鄧樹勛研究了遞增負荷運動后不同時刻心肌細胞凋亡調(diào)控基因表達的變化,發(fā)現(xiàn)運動后即刻,心肌表現(xiàn)出一種自我保護性的應激反應,運動后3 h與24 h,尤其24 h心肌細胞抗凋亡能力減弱[24]。有些學者不僅僅局限于心肌細胞本身,還研究了運動訓練對大鼠主動脈、房室節(jié)細胞凋亡的影響[25-27]。
本研究顯示耐力訓練后大鼠心肌細胞Bax表達顯著增加,Bcl-2的表達有明顯的增強,但是差異不顯著,二者的比值基本沒有變化,HE染色結(jié)果也證實心肌細胞結(jié)構(gòu)致密,表明耐力訓練沒有引起明顯的心肌細胞凋亡,反而促進了心臟的重塑,改善了心臟的功能。這一結(jié)果與大多數(shù)人的結(jié)論一致。同時我們發(fā)現(xiàn)耐力訓練顯著改善了高脂膳食大鼠的心肌細胞結(jié)構(gòu),不僅抵抗了高脂帶來的心肌細胞結(jié)構(gòu)的破壞,而且促進了運動性心臟肥大的發(fā)生??赡苁沁m宜的運動激活了心肌細胞內(nèi)存在的3道防御系統(tǒng)[28],通過抗氧化劑、抗氧化酶、脂肪分解酶、蛋白激酶等降低了活性氧的刺激,下調(diào)了Bax的表達,上調(diào)了Bcl-2的含量,造成二者比例的減小,抑制了心肌細胞凋亡的產(chǎn)生,使心肌細胞發(fā)生了適應性的重塑。
由于運動是一種特殊的刺激,給心肌細胞和心臟功能帶來了巨大的影響,尤其是過度訓練,所以特殊物質(zhì)的補充如賴氨酸[29]、苦豆子總堿[30]、山莨菪堿[19]、銀杏制劑[31]及還原型谷光甘肽[32]等對力竭運動大鼠心肌細胞凋亡的良性影響也備受關(guān)注。茶多酚作為新型天然抗氧化劑和生物學功能調(diào)節(jié)劑已引起國際學術(shù)界的普遍重視,國內(nèi)外專家對其藥用價值及其作用機制進行了大量研究。本研究發(fā)現(xiàn)茶多酚及耐力訓練的綜合效應對Bcl-2的影響不大,但Bax的表達顯著低于安靜高脂膳食組和耐力訓練對照組,Bax/Bcl-2也顯著降低。雖然從絕對數(shù)值上與安靜狀態(tài)下高脂膳食茶多酚組沒有太大差異,但HE染色結(jié)果和心臟系數(shù)有力地表明茶多酚補充與耐力訓練的綜合效應明顯降低了高脂膳食對心臟結(jié)構(gòu)的影響,其效果優(yōu)于單純的訓練和單純的茶多酚補充。我們的結(jié)果與趙永壽和張自治的實驗結(jié)論一致[4],推測其可能的原因是茶多酚的補充和運動訓練共同影響了大鼠脂肪代謝相關(guān)調(diào)控酶水平,使其血脂水平下降[5],減少了高脂膳食帶來的高血脂的風險;也可能直接提高了心肌線粒體的抗氧化能力[6],抑制細胞的脂質(zhì)過氧化、激活細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)、維持自由基代謝的平衡[33-34],從而減少Bax蛋白的表達,抑制通過線粒體途徑誘發(fā)的心肌細胞凋亡,促進心臟功能的改善。由于茶多酚對于運動機體的影響目前報道很少,尤其是茶多酚結(jié)合耐力訓練對高脂膳食大鼠心臟功能及心肌細胞凋亡的研究尚未見報道,我們只是對其進行了初步的探討,同時本實驗中茶多酚不同劑量的影響差異也不顯著,所以其在運動過程中發(fā)揮作用的機制還需更多實驗研究的證實。
長時間的耐力訓練使大鼠心臟發(fā)生運動性肥大,顯著提高了大鼠的心臟系數(shù)。高脂膳食導致大鼠心臟結(jié)構(gòu)破壞,心肌細胞凋亡增加;茶多酚可以改善高脂膳食大鼠的心臟結(jié)構(gòu),降低心肌細胞凋亡的程度。長時間耐力訓練沒有引起心肌細胞凋亡的增加,顯著改善了高脂膳食對大鼠心臟結(jié)構(gòu)的破壞。長時間耐力訓練與茶多酚的共同作用促進了心臟結(jié)構(gòu)的重塑。
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Influence of Tea Polyphenols and Endurance Training on the Structure of Myocardial Cells and Expression of Bax,Bcl-2 of Fat-rich Diet Rats
LUO Yanrui1,MEI Tao1,SUN Jingquan2
(1.School of PE,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China;2.School of Graduate,Beijing Sport University,Beijing 100084,China)
To observe the influence of tea polyphenols and endurance training on fat-rich diet rat's myocardial cell structure and expression of Bax,Bcl-2. Methods:64 male SD rats were randomly divided into eight groups:quietness control group(A);quietness fat-rich diet group(B);quietness fat-rich diet added low tea polyphenols group(C);quietness fat-rich diet added high tea polyphenols group(D);endurance training control group(E);endurance training and fat-rich diet group(F);endurance training and fat-rich diet added low tea polyphenols group(G);endurance training and fat-rich diet added high tea polyphenols group(H).There were 8 rats in each group.The tea polyphenols was supplemented with gavage and the dosages for group D and H were 300 mg/kg,for group C and G were 150 mg/kg respectively.The rest had been infused with equal amounts of distilled water.The rats in endurance training group carried on the swimming training 60 min for each day.In one week,6 was for training.The total duration was 6 weeks.Results:The myocardial fiber of group B rats was coarse,the blank area between myocardial increased.The structure of myocardial of group C and D was improved,the blank area between myocardial decreased.The myocardial fiber of the group of endurance training rats dandified.Compared with group A,the expression of Bax of group B's myocardial cell was significantly increased,the ratio of Bax/Bcl-2 increased.The level of Bax of group C and D decreased;the ratio of Bax/Bcl-2 decreased.The Bax/Bcl-2 ratio of rats'myocardial cell of group F is lower than that of group B.The Bax's expression of group G and H recovered to the level of group A,the ratio of Bax/Bcl-2 was significantly lower than that of group B.Conclusions:Fat-rich diet destroys the rats'myocardial forms,and the apoptosis of myocardial cell was increased.However,the damage of myocardial cells can be improved by adding tea polyphenols and endurance training.And the long-time endurance and tea polyphenols have a synergistic effect on the improvement of heart damage.
tea polyphenols;endurance training;fat-rich diet;heart;BAX;BCL-2
G 804.5
A
1005-0000(2011)04-0336-05
2011-03-11;
2011-06-10;錄用日期:2010-06-15
國家大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目(項目編號:091047643)
羅艷蕊(1974-),女,河南南樂人,副教授,在站博士后,研究方向為運動人體科學與體育信息學。
1.河南師范大學體育學院,河南新鄉(xiāng)453007;2.北京體育大學研究生部,北京100084。
茶多酚是茶葉中的酚類及其衍生物的總稱,作為一種天然的抗氧化劑已經(jīng)引起國際學術(shù)界的普遍重視,大量的動物、人體實驗及流行病學調(diào)查均證實茶多酚具有抗腫瘤、降血脂、降血壓、降糖、抑菌、抗病毒等多種藥理作用[1-3]。目前關(guān)于茶多酚功能的研究主要集中在臨床醫(yī)學上,在運動領(lǐng)域的研究較少。其中趙永壽和張自治采用茶多酚配合有氧運動的方式,發(fā)現(xiàn)茶多酚促進了肥胖青少年的脂肪代謝,減肥效果優(yōu)于單純的有氧運動[4]。馬蘭軍的實驗也表明茶多酚補充減慢了游泳大鼠體重和體脂的增長速度,提高了心肌線粒體的抗氧化能力[5-6]。但是關(guān)于茶多酚對肥胖大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)和細胞凋亡的影響尚未見報道,所以采用高脂膳食的方法構(gòu)建肥胖大鼠模型,觀察茶多酚及耐力運動對大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達的影響,從而為將茶多酚引入運動營養(yǎng)補劑提供實驗依據(jù)。