姜 山,韓 勇,費明旋,張守偉

運動疲勞大鼠心肌細胞L-型鈣通道生物物理特性的研究

姜 山,韓 勇,費明旋,張守偉

目的:研究運動疲勞對大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流及生物物理學(xué)特性的影響,證明L-型鈣通道直接參與到運動疲勞導(dǎo)致的細胞內(nèi)鈣濃度變化中。方法:48只大鼠雌雄不拘,隨機分成對照組和運動疲勞組。采用連續(xù)15天游泳耐力訓(xùn)練方法建立運動疲勞大鼠模型;應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測運動疲勞對大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流的影響。結(jié)果:1)運動疲勞大鼠全細胞L-型鈣電流峰值(IpeakCaL)顯著增加:全細胞IpeakCaL電流從-470± 11.73 pA變化到-819.90±10.78 pA,n=8,P<0.05,運動性疲勞組較對照組增幅74.60%;2)膜片鉗技術(shù)檢測L-型鈣電流的激活和失活通道動力學(xué)特性:運動疲勞模型組大鼠心肌細胞的L-型鈣電流的失活曲線右移,而激活曲線與對照組相比沒有變化。結(jié)論:運動疲勞引起大鼠L-型鈣通道特性改變,使得鈣電流增強,導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)鈣平衡調(diào)節(jié)紊亂。

L-型鈣通道;激活失活曲線;運動性疲勞;心室肌細胞;鼠;動物實驗

運動性疲勞指機體在生理過程中不能繼續(xù)在特定水平上進行或整個機體不能維持預(yù)定的運動強度[2]。運動性疲勞產(chǎn)生機制方面的研究,是當前體育科學(xué)中面對的重要課題,雖對此進行了廣泛而深入的研究,但導(dǎo)致運動疲勞的生理機制是一個極其復(fù)雜的問題,對于運動疲勞產(chǎn)生的原因以及其中的相關(guān)機制的研究仍存在許多爭議,并且存在許多假說[4],如中樞神經(jīng)疲勞學(xué)說、能量衰竭學(xué)說、神經(jīng)-肌肉疲勞學(xué)說、代謝產(chǎn)物堆積學(xué)說、氧自由基-脂質(zhì)過氧化學(xué)說、鈣離子代謝紊亂學(xué)說、體溫調(diào)節(jié)失衡學(xué)說等等,其中,離子代謝紊亂機制在運動性疲勞中的研究越來越受到人們的重視,而鈣離子平衡紊亂的研究最為重要。此外,運動性疲勞對心臟功能的影響雖有所研究,但其影響作用及機制仍然不清楚,尤其是在分子、細胞水平上對心肌細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)變化的研究沒有報道。

因此,本研究擬通過膜片鉗技術(shù)探索運動疲勞對心肌細胞L-型鈣通道電流及生物物理學(xué)特性激活失活曲線的影響,探索運動疲勞與鈣通道的關(guān)系,證明L-型鈣通道直接參與到運動疲勞導(dǎo)致的細胞內(nèi)鈣濃度變化中,導(dǎo)致心肌細胞發(fā)生鈣超載,造成心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

W istar大鼠48只(購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心),體重220 g±25 g,雌雄不拘,隨機分為運動疲勞組和對照組,每組24只,自由攝食,飼養(yǎng)環(huán)境溫度19℃± 4℃,相對濕度(50±10)%。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

儀器設(shè)備:L-型鈣通道離子電流測定使用膜片鉗系統(tǒng)(德國進口HEKA公司EPC-10)。

試劑:膠原酶Ⅱ型,美國Sigma公司;牛血清白蛋白,博越生物公司;尼莫地平,美國Sigma公司。標準溶液:Kraft Bruhe液;L-型鈣通道電極內(nèi)液;L-型鈣通道細胞外液。

1.3 實驗方法

1.3.1 運動疲勞模型的制備

對大鼠進行15天游泳力竭訓(xùn)練,實驗水深40 cm±5 cm,水溫30℃±2℃,前10天每天1次,每次3 h訓(xùn)練,后5天每天2次,每次3 h訓(xùn)練。力竭階段標準為大鼠沉入水底并且3 s內(nèi)無力返回水面,此時及時撈起,休息2 min后繼續(xù)游泳,并完成規(guī)定的訓(xùn)練時間。運動疲勞模型制備如下:每12只大鼠為1組,編號,第1天開始將編號為1的大鼠放入水池中進行游泳訓(xùn)練,第2天放入1號及2號大鼠,第3天放入1、2、3號大鼠,依次類推,到第12天加入編號為12的大鼠,共同游泳訓(xùn)練至規(guī)定天數(shù),該組大鼠疲勞模型建立完畢后,進行下一組疲勞模型建立實驗。

1.3.2 取樣

相應(yīng)編號的大鼠在其第15天的游泳訓(xùn)練近結(jié)束時,當大鼠出現(xiàn)沉入水底無力返回水面即力竭狀態(tài)下,立即取出該運動疲勞大鼠模型,不予任何休息恢復(fù),即刻頸部脫臼處死,迅速開胸取心,采用Langendorff離體灌流分離心肌細胞。

1.3.3 大鼠心室肌細胞分離

采用Langendorff法離體灌流心臟[3],大鼠頸部脫臼處死,迅速開胸取出心臟,置于4℃含Ca2+臺氏液清洗修剪,經(jīng)主動脈將心臟懸掛于Langendorff離體灌流裝置上,由主動脈進行逆向灌流,灌流液保持37℃、通入95%O2+5% CO2混合氣體。首先用含鈣臺式液灌流心臟復(fù)跳,泵出心腔內(nèi)殘留血液,更換為無鈣臺氏液灌流至心臟停止跳動,用含0.16 mg/m lⅡ型膠原酶和0.16 mg/ml牛血清白蛋白的無鈣臺氏液60 m l反復(fù)灌流心臟至心肌消化完全。消化結(jié)束后,剪下心室,在KB液(g/L:KOH 3.928,L-谷氨酸7.357,KCl 2.982,?；撬?.503,KH2PO42.722, MgCl2·6H2O 0.601,葡萄糖1.981,HEPES 2.383, EGTA 0.19,KOH調(diào)p H值至7.4)中剪塊、吹打,鏡檢含80%以上單個桿狀細胞后,置于KB液中4℃保存。

1.3.4 全細胞Ca2+通道電流的記錄

方法[3]將分離得到的心肌細胞滴加到細胞浴槽中,靜置至細胞貼壁,用細胞外液(g/L:Tris-Cl 21.43, CsCl 0.909,MgCl2·6H2O 0.203,HEPES 2.383,葡萄糖1.981,CaCl20.221,Tris-OH調(diào)p H值至7.4)灌流。拉制玻璃電極(入水電阻2～5 MΩ),充灌電極內(nèi)液(g/L:CsOH 16.49,aspartate 14.64,CsCl 3.367,MgCl2·6H2O 0.2, Mg-ATP 2.535,EGTA 3.8,HEPES 2.383,CsOH調(diào)節(jié)p H值至7.2)。玻璃電極與細胞膜接觸后,給予一個微弱負壓吸引形成1～5 GΩ的高電阻封接,再一次給予短暫迅速負壓,吸破細胞膜,形成全細胞記錄模式(Whole cell mode)。給予鉗制電壓-50 mV,命令電壓從-50 mV階躍到+50 mV,步進電壓10 mV,刺激脈沖持續(xù)300 ms,誘發(fā)L-型Ca2+通道電流,通過膜片鉗放大器模/數(shù)(A/D)轉(zhuǎn)換通道轉(zhuǎn)成數(shù)字信號,Pulse軟件采集,Pulsefit分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計軟件處理,結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,統(tǒng)計學(xué)分析采用樣本均數(shù)t檢驗進行各組間數(shù)值比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 運動性疲勞大鼠心肌細胞L型-鈣通道的ICaL電流的變化

采用膜片鉗技術(shù)測定大鼠心肌細胞L型-鈣通道電流,形成全細胞記錄模式后,電壓鉗模式下,鉗制電壓-50 mV,使用系列階躍電壓(-50 mV～50 mV)誘導(dǎo)出L-型鈣電流,-30 mV開始出現(xiàn)內(nèi)向電流,在10 mV達到最大峰電流,該電流可被尼莫地平(鈣通道阻斷劑,5μmol/L)抑制。

運動疲勞大鼠組ICaL峰電流顯著增強。全細胞ICaL峰電流比對照組增加74.60%(從-470±11.73 pA/p F變化到-819.90±10.78 pA/p F,n=8,P<0.05)。

2.2 運動性疲勞對大鼠心肌細胞L型-鈣通道穩(wěn)態(tài)激活動力學(xué)特征的影響

采用膜片鉗技術(shù)測定大鼠心肌細胞L型-鈣通道動力學(xué)特性,形成全細胞記錄模式后,電壓鉗模式下,鉗制電壓-50 mV,給以10 mV步階去極化至50 mV系列去極化脈沖,根據(jù)得到電流電壓關(guān)系曲線,由Boltzman方程擬合得到穩(wěn)態(tài)激活曲線。運動疲勞組大鼠L型-鈣與對照組相比激活曲線無顯著變化。

圖1 運動疲勞對大鼠心肌細胞ICaL的影響圖Fig 1. Effect of exercise-induced fatigue on whole cell L-type calcium current in rats.

圖2 運動性疲勞大鼠心肌細胞鈣通道穩(wěn)態(tài)激活動力學(xué)特征曲線圖Fig 2. Dynamic properties of activation curve of the exercise-induced fatigue rats.

2.3 運動性疲勞對大鼠心肌細胞L型-鈣通道穩(wěn)態(tài)失活動力學(xué)特征的影響

采用膜片鉗技術(shù)測定大鼠心肌細胞L型-鈣通道動力學(xué)特性,形成全細胞記錄模式后,電壓鉗模式下,采用雙脈沖刺激法,鉗制電壓-50 mV,從-60 mV以10 mV步階去極化至30 mV,持續(xù)時間1 500 ms,在每次條件脈沖后緊跟一個持續(xù)250 ms的固定的去極化至0 mV脈沖,然后回到鉗制電壓,將記錄到的ICaL經(jīng)Boltzman方程擬合得到穩(wěn)態(tài)失活曲線。運動疲勞組大鼠L型-鈣與對照組相比失活曲線發(fā)生右移,表明運動疲勞模型組的大鼠L-型鈣通道失活過程更難,運動疲勞抑制了鈣通道的失活過程,造成鈣通道關(guān)閉延遲,單位時間內(nèi)經(jīng)由鈣通道進入細胞內(nèi)的Ca2+數(shù)量增加,致使細胞內(nèi)鈣濃度調(diào)節(jié)紊亂。

圖3 運動性疲勞大鼠心肌細胞鈣通道動力學(xué)特征曲線圖Fig 3. Dynam ic properties of inactivation curve of the exercise-induced fatigue rats

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過2周力竭狀態(tài)的運動可使大鼠心肌細胞L-型鈣通道特性發(fā)生改變,鈣電流產(chǎn)生增強,鈣通道的失活曲線發(fā)生明顯右移,單位時間內(nèi)進入心肌細胞內(nèi)Ca2+數(shù)量增加,為解釋運動性疲勞引起細胞內(nèi)鈣超載機制提供了有力證據(jù)。由于大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流增強作用以及鈣通道生物物理學(xué)特性的改變,導(dǎo)致了細胞內(nèi)發(fā)生鈣超載,從而使心肌細胞產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變。

運動疲勞是運動訓(xùn)練過程的一個重要的問題,但對于運動疲勞產(chǎn)生的原因以及其中的相關(guān)機制的研究仍存在許多爭議。運動疲勞對心血管系統(tǒng)的影響方面,現(xiàn)認為在運動過程中,心臟提供的血流量已滿足不了工作肌肉對氧和營養(yǎng)物質(zhì)及運走過多代謝產(chǎn)物的需求[6],其中由于運動性疲勞而導(dǎo)致的心肌細胞鈣離子平衡的紊亂是對心肌損傷中甚為重要的環(huán)節(jié)。

Ca2+在維持身體結(jié)構(gòu)和細胞功能方面發(fā)揮著重要作用,幾乎體內(nèi)各種細胞功能均與鈣離子調(diào)節(jié)有關(guān)。Ca2+活潑的特性使其容易結(jié)合細胞內(nèi)的各種緩沖位點,這些位點通過結(jié)合肌鈣蛋白、收鈣素、鈣調(diào)蛋白和ATP等物質(zhì)[11],進而發(fā)揮重要的生理功能,所以,細胞內(nèi)鈣離子是調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他細胞生理過程重要的第二信使。而在心肌細胞中,游離鈣作為偶聯(lián)因子誘發(fā)心肌細胞興奮與收縮偶聯(lián),進而產(chǎn)生心肌收縮,同時,胞內(nèi)鈣對增強心肌收縮力及收縮速率方面有著重要的作用,因此,不管心肌外部的調(diào)節(jié)機制多復(fù)雜,最后都可以歸結(jié)為細胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)[5]。

近年來,運動性疲勞中Ca2+在心臟的代謝已受到重視。以往的研究認為,Ca2+在運動性疲勞中起著至關(guān)重要的作用,尤其是其對線粒體膜結(jié)構(gòu)以及功能的影響方面。運動性狀態(tài)下心肌線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了明顯變化,這些變化可能是引起疲勞狀態(tài)下心肌損傷的主要原因[4,1],而線粒體的這種損傷也與細胞內(nèi)鈣離子有直接關(guān)系。細胞以及線粒體內(nèi)的鈣聚集嚴重影響細胞正常功能,導(dǎo)致細胞產(chǎn)生程序性死亡(凋亡),細胞內(nèi)鈣超載常作為細胞結(jié)構(gòu)損傷的特征,線粒體內(nèi)的鈣代謝紊亂超載將造成細胞不可逆損害[9,11]。所以,Ca2+在運動性疲勞中起著重要的作用,有可能是其產(chǎn)生的一個中樞機制,即胞漿內(nèi)鈣超載、線粒體里鈣聚集是造成力竭損傷的主因。而關(guān)于心肌細胞胞漿內(nèi)鈣超載機制研究甚少。心肌細胞胞漿內(nèi)鈣濃度的增加主要是通過肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放或由細胞膜上的鈣離子通道進入的兩種方式實現(xiàn)的[10]。因此,在本研究中,我們通過膜片鉗技術(shù)檢測了正常大鼠和運動疲勞大鼠心肌細胞膜L-型鈣通道電流的變化,以及運動疲勞后大鼠心肌細胞膜L-型鈣通道生物學(xué)特性的改變,通過對于運動疲勞后鈣通道的研究,揭示導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+增多、造成細胞內(nèi)鈣超載、最終使心肌細胞內(nèi)Ca2+平衡調(diào)節(jié)紊亂的原因。我們的研究發(fā)現(xiàn):1)運動性疲勞大鼠心肌細胞L-型鈣通道ICaL峰電流的顯著增強:全細胞ICaL峰電流從-470±11.73 pA/p F變化到-819.90±10.78 pA/p F,比對照組增加了74.60%,表明與正常細胞相比,運動疲勞后的心肌細胞單位時間內(nèi)通過細胞膜L-型鈣通道進入細胞內(nèi)的Ca2+數(shù)量顯著增加,造成細胞內(nèi)鈣超載;2)通過對運動疲勞大鼠的L-型鈣通道的動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),該組大鼠L型-鈣通道失活曲線發(fā)生了右移,激活曲線無變化,表明運動疲勞模型組的大鼠L-型鈣通道失活過程更難,運動疲勞抑制了鈣通道的失活過程,造成鈣通道關(guān)閉延遲,單位時間內(nèi)經(jīng)由通道進入細胞的鈣離子數(shù)量增加,這種鈣通道生物物理學(xué)特性的改變導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的紊亂。

本研究首次直接觀察到了由于力竭運動而導(dǎo)致大鼠心肌細胞膜L-型鈣通道電流增強作用,證實了運動性疲勞產(chǎn)生的細胞內(nèi)鈣超載部分直接因素是通過改變細胞膜L-型鈣通道生物物理學(xué)特性而實現(xiàn)的,揭示了運動疲勞狀態(tài)下細胞內(nèi)鈣離子濃度升高的分子、細胞生理學(xué)機制,對于解釋力竭造成的心肌細胞損傷有重要意義,為在體育運動訓(xùn)練中,選擇合適的訓(xùn)練強度提高運動成績,提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

作者研究了力竭運動對大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流的變化及鈣通道生物物理學(xué)特性的改變,發(fā)現(xiàn)2周的力竭運動可導(dǎo)致心肌L-型鈣通道電流振幅增強,激活曲線無變化,失活曲線顯著右移,證明了L-型鈣通道電流及生物物理學(xué)特性改變是運動疲勞導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載的直接原因之一的分子、細胞生理學(xué)機制,由此產(chǎn)生細胞內(nèi)鈣超載、鈣平衡調(diào)節(jié)紊亂。

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Study of Biophysical Properties of L-type Calcium Channel in Rat M yocardial Cells with Exercise-induced Fatigue

JIANG Shan,HAN Yong,FEIM ing-xuan,ZHANG Shou-wei

Objective:To study the effects of exercise-induced fatigue on m yocardial cells L-type calcium currents and biophysical p roperties in rats;to p rove that L-type Ca2+channel participates directly in the change of[Ca2+]i.due to exercise-induced fatigue.Methods:48 rats,male o r female,were divided into control group and exercise-induced fatigue group random ly.15 days endurance sw imming training w as adopted to establish exercise-induced fatigue models; patch clamp technique was app lied to exam ine the effects of exercise-induced fatigue on m yocardial L-type calcium currents in rats.Results:1)The w hole cell L-type Ca2+channel peak currents obviously increased in exercise-induced fatigue rats:the w hole cell L-type Ca2+channel peak currents increased from-470±11.73pA to-819.90±10.78pA(n=8,P< 0.05),the exercise-induced fatigue group increased 74.60%compared w ith the control group. 2)Using patch clamp technique to examine the activation of L-type Ca2+channel currents and dynam ic p roperties of inactivation channel:Inactivation curve shifted to the right in the exercise-induced fatigue group compared w ith the control group,activation curve in the exercise-induced fatigue group did not alter compared w ith the control group.Conclusion:Exercise-induced fatigue changes biophysical p roperty of L-type Ca2+channel,and enhances L-type Ca2+channel currents and causes disorders in calcium balance adjustment.

L-type calcium channel;activation and inactivation curve;exercise-induced fatigue;m yocardial cell;rat

G804.2

A

1000-677X(2011)11-0048-04

2011-03-17;

2011-10-10

姜山(1977-),男,吉林長春人,講師,博士,研究方向為運動訓(xùn)練學(xué),E-mail:jiangs667@nenu.edu.cn;韓勇(1974-),男,黑龍江哈爾濱人,講師,博士,研究方向為心臟生理學(xué),E-mail:hany837@nenu.edu.cn;費明旋(1986-),男,黑龍江綏化人,碩士,研究方向為體育教學(xué)訓(xùn)練原理與方法,E-mail:feim xbest@126.com;張守偉(1974-),男,吉林臨江人,副教授,博士,研究方向為體育教學(xué)訓(xùn)練原理與方法,E-mail:zhangsw178@nenu.edu. cn。

東北師范大學(xué),吉林長春130024 No rtheast Normal University,Changchun 130024, China.