摘要：以TGEV(豬傳染性胃腸炎病毒)基因組序列為基礎(chǔ)，運(yùn)用Gamier-Robson、chou-Fasman和Karplus-Schulz方法預(yù)測(cè)其s蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Kyte-Doolittle方法對(duì)s蛋白的親水性進(jìn)行分析，并分別運(yùn)用Jameson-Wolf方法和Emini方法預(yù)測(cè)了其抗原指數(shù)和表面可及性，最后結(jié)合吳玉章的方法綜合分析預(yù)測(cè)了其B細(xì)胞抗原表位。結(jié)果顯示，a螺旋數(shù)量少且分散，B折疊占據(jù)面積較大，柔性區(qū)域主要集中在N端第22～30、45～76、100～172、239～301、348～419、451～519、541～633、645～720、746～796、822～887、921～986、1052～120l、1239～1384、1434～1445區(qū)段。s蛋白可能的B細(xì)胞抗原位點(diǎn)是N端第20～32、44～54、69～78、97～106、635～655、781～803、949～994、1307～1328、1346～1362、1432～1448區(qū)段，這些區(qū)段內(nèi)部或附近都有柔性區(qū)域存在，可作為s蛋白的抗原優(yōu)勢(shì)表位。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒；S蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)；B細(xì)胞抗原表位

中圖分類號(hào)：Q518.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942(2010)12—0006—05

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroen-terids virus of swine，TGEV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是引起豬傳染性胃腸炎的主要病原，可導(dǎo)致7～10日齡以內(nèi)仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和高死亡率(通常100％)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。

TGEV病毒粒子的直徑為90～200nm，呈球形或橢球形，具有囊膜，囊膜外有一層呈花瓣?duì)畹睦w突(spike，S)。TGEV基因組為不分段的單股正鏈RNA，可分為7個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)有一個(gè)或多個(gè)開放閱讀框(ORF)，整個(gè)基因組的順序?yàn)椋?′－20RFla－ORF1b3／S－ORF3a－ORF3b－SM－M－N－ORF7－3′。ORF2基因編碼的纖突糖蛋白(s蛋白)是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白。S基因全長(zhǎng)4.35×10bp，翻譯產(chǎn)物為1450個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為158ku。S蛋白至少有五種作用：(1)攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白；(2)含有宿主細(xì)胞氨肽酶受體(PAPH)的識(shí)別位點(diǎn)，決定其宿主組織細(xì)胞親嗜性；(3)決定TGEV的毒力；(4)具有融細(xì)胞膜的作用，協(xié)助病毒核蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞；(5)決定TGEV的血凝活性。本研究根據(jù)TGEV病毒s蛋白基因推導(dǎo)的氨基酸序列，利用免疫信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位，為合理選擇B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，進(jìn)而為研究s蛋白特征、單克隆抗體制備和研制表位疫苗奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

TGEV分析參考株來(lái)自GenBank，登陸序列號(hào)為DQ811789，其S蛋白共由1450個(gè)氨基酸殘基組成(見圖1)。

1.2 方法

1.2.1 S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 運(yùn)用Gamier-Robson、Chou-Fasmant和Karplus-Schulz方法預(yù)測(cè)TGEV S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 TGEV S蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)運(yùn)用Kyte-Doolitfle方法對(duì)s蛋白的親水性進(jìn)行分析，用Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)s蛋白的抗原指數(shù)，用Emini方法預(yù)測(cè)S蛋白的表面可及性。然后綜合分析，兼顧各項(xiàng)預(yù)測(cè)參數(shù)推斷S蛋白B細(xì)胞表位，并用吳玉章等建立的抗原性指數(shù)(AI)對(duì)預(yù)測(cè)的表位進(jìn)行綜合評(píng)判。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGEV S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

運(yùn)用Chou-Fasman法和Gamier-Robson法預(yù)測(cè)α螺旋、β折疊和轉(zhuǎn)角區(qū)域，兩種方法預(yù)測(cè)結(jié)果不盡相同，但大部分區(qū)域重疊(見圖2、圖3)。S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋比較分散，沒有大面積的聚集區(qū)域，主要集中在第83～96、177～190、210～227、310～320、466～478、677～685、885～922、1137～1209、1340～1385區(qū)段；B折疊占據(jù)了較大面積，但因α螺旋、β折疊兩種結(jié)構(gòu)均含有氫鍵，鍵能比較高，能夠較牢固地維持蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，不易形成抗原表位。轉(zhuǎn)角區(qū)和無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)段分布很廣。運(yùn)用Karplus-Schulz方法可以預(yù)測(cè)得出柔性區(qū)域占氨基酸總數(shù)的39.1％，主要的柔性區(qū)段大致為第22～30、45～76、100～172、239～301、348～419、451～519、541～633、645～720、746～796、822～887、921～986、1052～1201、1239～1384、1434～1445區(qū)段。

2.2 S蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)

按照Kyte-Doolittle、Jameson-Wolf、Emini方法分別預(yù)測(cè)S蛋白親水性、抗原指數(shù)和表面可能性，結(jié)果見圖4，其中高于閾值的肽段即為預(yù)測(cè)的抗原表位。Jameson-Wolf方案綜合分析了蛋白的親水性、表面可及性、可塑性及二級(jí)結(jié)構(gòu)，根據(jù)一定的公式計(jì)算抗原指數(shù)，是常采用的方案之一。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示N端第17～32、41～54、66～78、97～106、118～175、198～215、236～259、320～326、349～357、392～400、414-424、449～457、504～517、537～547、558～710、781～793、822～831、866～877、921～941、949～994：1011～1016、1057～1064、1080～1094、1131～1153、1167～1199、1238～1247、1258～1288、1318～1328、1345～1362、1432～1448區(qū)段為抗原指數(shù)較高的區(qū)域。

將各種方案預(yù)測(cè)的可能性表位列于表1。從表中可以發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同的預(yù)測(cè)方法，其預(yù)測(cè)的抗原表位個(gè)數(shù)和抗原表位可能出現(xiàn)的肽段有所不同。但S蛋白第20～32、44～54、69～78、97～106、118～175、239～259、558～623、635～655、660～710、781～803、949～994、1166～1199、1238～1287、1307～1328、1346～1362、1432～1448區(qū)段顯示多種預(yù)測(cè)方法基本一致，有較好的親水性、可及性和較高的抗原指數(shù)，并且在二級(jí)結(jié)構(gòu)上含有易形成抗原表位的轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，因此B細(xì)胞抗原表位可能在這些區(qū)域內(nèi)或者附近。

吳玉章根據(jù)98個(gè)表位分析病毒蛋白B細(xì)胞表位的殘基構(gòu)成，并與參照蛋白的氨基酸構(gòu)成相比較，建立了20種殘基的抗原指數(shù)(antigenic in-dex，AI)。結(jié)合表l中的數(shù)據(jù)，用該方法計(jì)算s蛋白可能的B細(xì)胞表位的平均抗原指數(shù)，結(jié)果見表2，可見S蛋白20～32、44～54、69～78、97～106、635～655、781～803、949～994、1307～1328、1346～1362、1432～1448區(qū)段的抗原指數(shù)較高，提示它們可能是B細(xì)胞表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)段。

3 討論

自親水性參數(shù)用于預(yù)測(cè)抗原表位以來(lái)，隨著分子免疫學(xué)與免疫信息學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在已有多種算法用于B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)，主要有二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、抗原指數(shù)以及柔韌性等參數(shù)，應(yīng)用單參數(shù)預(yù)測(cè)模型，均有成功預(yù)測(cè)某種蛋白類型抗原表位的報(bào)道。但單參數(shù)預(yù)測(cè)有其局限性，就親水性和可及性而言，雖然二者是形成表位的首要條件，但并不能表示一定具有抗原性。表位的形成是多種因素綜合作用的結(jié)果，本研究綜合分析多種參數(shù)，以提高s蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

Gamier－Robson方法主要用于計(jì)算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性，Chou-Fas-man方法是通過(guò)序列氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，Karplus-Schulz方法可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性。α螺旋和β折疊由于化學(xué)鍵鍵能比較高，能夠較牢固地維持蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，很難與抗體結(jié)合，且經(jīng)常位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，所以很少能夠成為抗原表位的所在區(qū)域。而蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲等柔性結(jié)構(gòu)則比較松散，易發(fā)生扭曲、盤旋并容易出現(xiàn)在蛋白的表面，所以成為表面抗原的可能性較大。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，s蛋白的柔性區(qū)段分布較廣，各區(qū)段之間相距較近，容易形成大面積的扭曲和盤旋，為B細(xì)胞抗原位點(diǎn)的存在提供了良好的條件。用Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)的抗原指數(shù)可以作為B細(xì)胞抗原位點(diǎn)的證明，但是僅僅從抗原指數(shù)這一項(xiàng)指標(biāo)來(lái)確定B細(xì)胞抗原位點(diǎn)有些片面，因?yàn)槎嚯脑谛纬梢職さ鞍讜r(shí)會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，有些抗原指數(shù)較高的區(qū)段會(huì)被外層的氨基酸殘基屏蔽，另外氨基酸的親水性大小也會(huì)影響優(yōu)勢(shì)抗原表位的形成。

本文預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位的手段是建立在氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，忽略了氨基酸的分子間作用力，故對(duì)構(gòu)象依賴性抗原表位的預(yù)測(cè)有一定局限性。單克隆抗體和疫苗的制備均與目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位密切相關(guān)，本試驗(yàn)結(jié)果可以作為確定TGEV s蛋白潛在優(yōu)勢(shì)表位的參考，為設(shè)計(jì)疫苗時(shí)人為除去基因片段中無(wú)用或有不良影響的區(qū)段，從而研制出更加高效安全的疫苗，提供了合理的基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。