摘要：采用四因素三水平的正交試驗法對當(dāng)歸多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明，提取當(dāng)歸多糖的最佳工藝條件為：蒸煮溫度80℃，時間3 h，料水比1：15，醇析濃度為60％。在上述工藝條件下，浸提液兩次合并，可使當(dāng)歸多糖的提取得率達(dá)6.13％。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸多糖；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號：S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001—4942(2010)12—0081—04

當(dāng)歸[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]屬傘形科當(dāng)歸屬，是一種多年生草本植物。其干燥的貯藏根是一味常用中藥材，歷代本草均有記載，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂之“當(dāng)歸味溫，主呃逆上氣”，被列為中品。當(dāng)歸有補血、和血、調(diào)經(jīng)止血、潤腸滑腸等多種功效，為醫(yī)家常用，素有“十方九歸”之稱。當(dāng)歸良好的藥理作用與其所含的化學(xué)成分直接相關(guān)，現(xiàn)代化學(xué)分析表明，當(dāng)歸的主要成分為多糖、阿魏酸、揮發(fā)油等。

現(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸中的多糖具有多種生物活性，可提高免疫力，對造血系統(tǒng)有明顯的促進(jìn)作用，對多種腫瘤和輻射損傷也顯示出較好的療效。但目前很難在市場上見到當(dāng)歸多糖及其系列產(chǎn)品，原因主要是缺乏大規(guī)模高效率制備當(dāng)歸多糖的工藝技術(shù)，對當(dāng)歸多糖提取工藝的探討報道甚少。

本試驗通過正交試驗法對當(dāng)歸多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，力求找到一種操作簡單、多糖得率較高的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全當(dāng)歸(市售品)。

1.2 試驗試劑

濃硫酸、苯酚、無水葡萄糖、濃鹽酸、牛血清蛋白、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅、次甲基藍(lán)、氫氧化鈉、95％食品級酒精等(除酒精外其它均為分析純)。

1.3 試驗儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫水浴鍋、721可見分光光度計、752紫外一可見分光光度計、消化爐、凱氏定氮儀、電子分析天平(萬分之一)、離心機等。

1.4 當(dāng)歸中水分的測定

采用干燥恒重法。取9個洗凈的稱量瓶，放人105℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱至恒重；將當(dāng)歸干品各取3份，每份約3g，切片后放人稱量瓶，置于105℃干燥箱中，每隔2h取出冷卻至室溫，稱重；反復(fù)數(shù)次，直至恒重。

1.5 提取當(dāng)歸多糖的工藝流程

當(dāng)歸→稱重→烘干→切片→熱水浸提→過濾→濾液醇析→粗多糖→復(fù)溶→去除雜蛋白→多糖粗品→脫色→冷凍干燥→多糖干品。

1.6 當(dāng)歸水溶性多糖的含量測定

采用苯酚－硫酸法，以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取分析純無水葡萄糖40mg，用蒸餾水定溶于1000ml容量瓶中。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml，分別置于具塞試管內(nèi)，各加蒸餾水至2.0ml，再各加苯酚液1.0ml，搖勻，迅速滴加濃H₂SO₄ 5.0ml(總體積為8.0ml)，即刻搖勻，放置于25℃恒溫水浴中，10min后搖一次，再放置20min，取出。另取2.0ml蒸餾水，加入試劑同前法操作，作空白對照，于490nm處測定其光密度(OD值)。然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線供測定多糖含量之用。

1.6.3 當(dāng)歸多糖樣品含量測定 吸取樣品液1.0ml(相當(dāng)于40kg左右的多糖)，按上述步驟操作，測光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.7 當(dāng)歸水溶性多糖提取條件的優(yōu)化

采用L₂(3⁴)正交試驗法。影響當(dāng)歸多糖提取的因素很多，現(xiàn)針對提取溫度、物料與加水量之比、提取時間、醇析濃度4個主要因素，分3個水平(表1)，采用L₂(3⁴)交試驗法來安排試驗，以確定提取當(dāng)歸多糖的最優(yōu)化條件。根據(jù)因素水平表，分9組試驗，每組20g，提取多糖經(jīng)乙醇沉淀后，稱干重(60℃低溫干燥)后測多糖。

1.8 提取次數(shù)對當(dāng)歸水溶性多糖提取率的影響

采用一次煮出浸提法，可能仍有殘?zhí)?，為確立最佳提取次數(shù)，獲得較高的多糖得率，本試驗采用多次蒸煮浸提，分別檢測多糖得率。具體操作為：稱取剪成碎片的當(dāng)歸3份，每份20g，各加15倍水，于100℃浸提3h后過濾濃縮，連續(xù)浸提3次，測其多糖得率。

1.9 當(dāng)歸水溶性多糖中雜蛋白的去除

采用Sevag法。氯仿：正丁醇=4：1，樣品：(氯仿+正丁醇)=1：1，樣品中的蛋白質(zhì)與混合液形成的絮狀物用離心法除去，反復(fù)數(shù)次直到雜蛋白基本除凈。

1.10 當(dāng)歸水溶性多糖中雜蛋白的含量測定

采用紫外分光光度計法測定當(dāng)歸多糖樣品中雜蛋白(Pr)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸中水分含量的測定

市售當(dāng)歸水分含量較高，干燥恒重法測定為19.99％，可能與其所含的果膠質(zhì)較多有關(guān)，在工業(yè)生產(chǎn)中需預(yù)先干燥后再粉碎。

2.2 當(dāng)歸水溶性多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度系列的OD值測定結(jié)果見表2。

以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖l，回歸分析可得：

Y=0.0446X-0.0015，R²=0.9996。

2.3 當(dāng)歸水溶性多糖提取的L₂(3⁴)正交試驗方案及結(jié)果

利用多糖溶于水或酸、堿、鹽溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有機溶劑的特點，可用水、稀酸、稀堿、稀鹽溶液從原料中提取多糖，提取液經(jīng)濃縮后以等量的乙醇沉淀。因采用酸、堿性溶液進(jìn)行提取時多糖易發(fā)生降解，難以保證多糖的天然性及其活性；稀鹽溶液提取時易引入新雜質(zhì)等原因，故本試驗中采用熱水浸提，提取液經(jīng)濃縮后用食用酒精沉淀的方法來制備當(dāng)歸多糖。試驗方案及結(jié)果見表3。

表3反映了不同因素水平對當(dāng)歸粗多糖得率的影響。由極差大小R_D＞R_A＞R_C＞R_B分析可知，影響當(dāng)歸水溶性多糖得率的主次順序依次為醇析濃度，提取溫度，料水比，提取時間。因素A₁＞A₂＞A₃，B₂＞B₃＞B₁，C₃＞C₂＞C₁，D₁＞D₂＞D₃，所以，最佳提取工藝條件為A₁B₂C₃D₁，即提取溫度為80，提取時間為3h，料水比為1：15，醇析濃度為60％。在此最佳工藝條件下，浸提液兩次合并，可使水溶性當(dāng)歸多糖的提取得率達(dá)6.13％。

2.4 當(dāng)歸水溶性多糖最佳提取次數(shù)的確定

由表4可以、看出，對當(dāng)歸水溶性多糖的提取，多糖的得率第一次很高，第二次比較高外，第三次的得率已經(jīng)相當(dāng)?shù)土?，考慮到提取劑用量以及實際生產(chǎn)過程中的周期等方面的原因，對當(dāng)歸多糖的提取還是以進(jìn)行兩次較好。

2.5 當(dāng)歸多糖粗品的純化

當(dāng)歸粗多糖干品中的雜質(zhì)主要為雜蛋白(雜蛋白的含量約為10.51％)與色素，除蛋白質(zhì)較好的方法是采用Sevag法。

用Sevag法除雜蛋白，加入氯仿／正丁醇時應(yīng)在不斷攪拌下進(jìn)行，加入后明顯分為兩層，但蛋白層不明顯，可靜置1h后，將下層離心。離心后明顯分為三層，上層為多糖溶液；中間為一薄層絮狀沉積物，即為雜蛋白；下層為有機萃取劑層。取糖液與離心前上層糖液合并，再經(jīng)反復(fù)醇沉、除雜，直至雜蛋白基本除凈。脫掉雜蛋白后的多糖可用脫色劑或雙氧水除色素。之后將當(dāng)歸多糖冷凍干燥，最后可得較純的當(dāng)歸多糖。當(dāng)歸多糖干品在室溫下放置，其外觀、吸濕性、多糖含量、溶液pH值等均無明顯變化。

3 小結(jié)

多糖廣泛存在于自然界當(dāng)中，是多種中草藥的有效成分之一，具有多種生物活性，是理想的免疫增強劑。本試驗采用正交試驗法對水溶性當(dāng)歸多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，找出適用于生產(chǎn)的最佳提取工藝，可為進(jìn)一步深入開發(fā)當(dāng)歸多糖及其系列產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。