摘要：試驗(yàn)采用秋水仙堿加入培養(yǎng)基和秋水仙堿溶液浸泡處理大蒜愈傷組織，經(jīng)染色體數(shù)目鑒定表明，這兩種方法都能有效地誘導(dǎo)四倍體細(xì)胞。加入培養(yǎng)基法在誘導(dǎo)率和操作上都優(yōu)于液體浸泡法。其中以在培養(yǎng)基中加入0.08％秋水仙堿，處理4 d的誘導(dǎo)效果較好，加倍率達(dá)26.0％。

關(guān)鍵詞：秋水仙堿；大蔥；愈傷組織；多倍體

中圖分類(lèi)號(hào)：S633.1；S335.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942(2010)12—0015—03

秋水仙堿是一種化學(xué)誘變劑，它與離體培養(yǎng)相結(jié)合能夠加大多倍體的變異頻率。張興平等(1994)在西瓜幼胚子葉不定芽再生的前7d，在再生培養(yǎng)基中添加0.05％的秋水仙堿，大大提高了組織培養(yǎng)再生四倍體的頻率和效率。郭啟高等(2000)用秋水仙堿溶液處理培養(yǎng)材料并在西瓜芽再生培養(yǎng)基中添加6-BA，即可產(chǎn)生高頻率的四倍體變異。本研究利用離體培養(yǎng)與秋水仙堿相結(jié)合獲得了大蔥多倍體細(xì)胞，為大蔥多倍體育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

組織培養(yǎng)的外植體材料為章丘大蔥的成熟種子；離體誘導(dǎo)多倍體的材料為章丘大蔥成熟胚培養(yǎng)繼代一次的愈傷組織；細(xì)胞學(xué)觀察取培養(yǎng)中分裂旺盛的愈傷組織。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌外植體的獲得 先將種子用自來(lái)水沖洗10min，在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上用75％酒精漂洗30～60s，轉(zhuǎn)至0.1％升汞中消毒8～10min，最后用無(wú)菌水沖洗3～4次，在無(wú)菌狀態(tài)下催芽，至芽長(zhǎng)1cm左右時(shí)待用。

1.2.2 培養(yǎng)條件 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，另外分別添加2，4-D、KT、6-BA、NAA，蔗糖3％，瓊脂0.9％，pH5.9～6.0，于高壓自動(dòng)滅菌鍋中消毒20min。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，除愈傷組織誘導(dǎo)在黑暗條件下外，光照均為3000lx，每天光照12h。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2.0mg／L 2，4-D+1.0mg／L 6-BA

分化培養(yǎng)基：MS+1.5mg／L6-BA

1.2.3 處理方法 秋水仙堿處理按陳伯君等(2000)采用的兩種處理方法：

(1)秋水仙堿加入培養(yǎng)基法：從繼代培養(yǎng)中選擇淺黃色的愈傷組織切成約0.2m³左右的小塊，轉(zhuǎn)入含有秋水仙堿濃度分別為0.04％、0.06％、0.08％、0.10％、0.12％的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，處理時(shí)間分別為2、4、6d，共15個(gè)組合。處理完畢后，轉(zhuǎn)入不含秋水仙堿的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

(2)秋水仙堿溶液浸泡法：將秋水仙堿配制成濃度分別為0.02％、0.04％、0.06％、0.08％的溶液，并進(jìn)行消毒滅菌，將愈傷組織切成0.2 em3的小塊，在上述溶液中分別浸泡4、8、12h后取出，無(wú)菌水沖洗3～4次后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.4 愈傷組織染色體鑒定 所有處理后的愈傷組織在不含秋水仙堿的愈傷組織分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后，在無(wú)菌條件下取部分愈傷組織進(jìn)行染色體鑒定。用顯微鏡隨機(jī)觀察200個(gè)分裂相細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)多倍體細(xì)胞數(shù)，計(jì)算加倍率。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙堿加入培養(yǎng)基法對(duì)愈傷組織多倍體的誘導(dǎo)

由表1可以看出，秋水仙堿處理后，不同處理均得到了四倍體細(xì)胞，其中以0.08％的秋水仙堿處理4d效果最好，加倍率達(dá)26.0％。秋水仙堿濃度過(guò)高過(guò)低均不利于提高愈傷組織細(xì)胞的加倍率。但也看出，秋水仙堿處理濃度低、時(shí)間長(zhǎng)或濃度高、時(shí)間短時(shí)，也有利于提高愈傷組織細(xì)胞的加倍率。

2.2 秋水仙堿溶液浸泡處理對(duì)愈傷組織多倍體的誘導(dǎo)

由表2可以看出，秋水仙堿溶液浸泡處理法對(duì)愈傷組織染色體加倍的誘導(dǎo)率稍低于秋水仙堿加入培養(yǎng)基法，但變化規(guī)律基本一致。秋水仙堿的處理濃度以0.06％為佳。浸泡時(shí)間以8h為好。用0.06％的秋水仙堿浸泡愈傷組織8h的多倍體誘變率最高，達(dá)到22.5％，繼續(xù)升高濃度或延長(zhǎng)時(shí)間，加倍效果呈下降趨勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

3.1 秋水仙堿處理愈傷組織的方法

本試驗(yàn)采用了秋水仙堿加入培養(yǎng)基法和浸泡法處理愈傷組織，二者均獲得了一定頻率的多倍體細(xì)胞。經(jīng)過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)秋水仙堿溶液浸泡法處理的死亡率較高，可能因浸泡法藥液較容易滲入愈傷組織細(xì)胞中，從而抑制紡錘絲的形成，并且處理中浸泡在藥液中易造成缺氧而死亡，再加上秋水仙堿的毒害性，造成死亡率較高。另外，浸泡法在愈傷組織轉(zhuǎn)移過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)多次沖洗，增加了受污染的幾率。秋水仙堿加入培養(yǎng)基法無(wú)論在誘導(dǎo)率還是在存活率上都優(yōu)于浸泡法，這與王鴻鶴等(1999)的觀點(diǎn)一致。但是，也有人認(rèn)為浸泡法效果更佳，還有的認(rèn)為將愈傷組織先浸泡，然后接種于含一定濃度的秋水仙堿的培養(yǎng)基中效果更好，這可能與不同試驗(yàn)材料有關(guān)。

3.2 秋水仙堿最佳處理濃度與時(shí)間組合的選擇

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在離體材料的誘導(dǎo)中，秋水仙堿濃度高，處理時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致材料死亡率高，但多倍體誘變率并不一定提高；而濃度低，處理時(shí)間短，則不易得到加倍的植株；只有在適宜的處理濃度和時(shí)間才能獲得較高的誘導(dǎo)率，這與張承妹等(1995)在黃瓜四倍體研究中所得結(jié)論一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，用0.08％的秋水仙堿濃度處理4d效果較好，四倍體誘導(dǎo)率達(dá)26.0％。但也有人認(rèn)為，用高濃度的秋水仙堿進(jìn)行短時(shí)間處理效果好，如張俊蓮(1995)對(duì)當(dāng)歸的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)秋水仙堿高濃度與較短時(shí)間的處理組合最好。上述結(jié)果表明，不同材料在加倍處理時(shí)方法可能不完全相同。