摘要：克隆了水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)的外殼蛋白S10基因的片段和甘蔗花葉病毒(SCMV)的外殼蛋白CP基因的片段，將兩個片段在pMDl8－T Simple Vector上連接起來。獲得的S10－cP片段全長為830bp，將其分別以正向和反向插入植物表達載體pMCGl61，構(gòu)建了含兩種不同病毒來源基因的RNAi植物表達載體pMCGl61－CP10，為進一步轉(zhuǎn)化玉米，探索利用RNAi技術(shù)同時防治玉米矮花葉病和玉米粗縮病奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米；RNAi；S10基因；CP基因

中圖分類號：Q782 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001—4942(2010)08—0001—04

玉米粗縮病和玉米矮花葉病為我國玉米上的重要病害。方守國等(2000)研究表明，我國玉米粗縮病主要是由水稻黑條矮縮病毒(mce Black—streaked Dwarf virus，RBsDV)引起的，而蔣軍喜等(2003)研究表明，我國玉米矮花葉病主要是由甘蔗花葉病毒(sugar Cane Mosaic Virug，sc—MV)引起的，這兩種玉米病毒病近年在各地大面積發(fā)生，給玉米生產(chǎn)造成巨大損失。 本研究將RBsDV S10基因的部分序列片段和scMV CP基因的部分序列片段連接起來，通過正、反向插入雙元載體，構(gòu)建了具有反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的RNAi植物表達載體，為獲得雙抗病毒轉(zhuǎn)基因玉米奠定了基礎(chǔ)。

1、材料與方法

1．1材料

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5_a；用于轉(zhuǎn)基因沉默的專用dsRNA植物雙元表達載體pM-CGl61，由亞利桑那大學(xué)JOrgensen實驗室提供；pMDl8-T Simple載體購自TaKaRa公司；SCMVCP基因的克隆質(zhì)粒，由本實驗室提供；RBSDVS10基因的克隆質(zhì)粒，由本校李向東教授惠贈。

1．2分子生物學(xué)與生化試劑

PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MarkerV、D12000等購自北京全式金公司；限制性內(nèi)切酶EcoRV、RsrⅡ、BamH I、Sac I、Spe I、T4 DNA Ligase等購自TaKaRa公司；引物由北京博尚公司合成。

1．3引物合成

針對GenBank數(shù)據(jù)庫中眾多RBSDV S10和SCMV CP的基因組序列，用軟件DNAMAN進行同源性分析，選取相對保守的S10中406 bp片段(對應(yīng)S10基因592～998 bp)和SCMV CP中424bp片段(對應(yīng)CP基因648～1072 bp)，利用軟件Primer 5．O進行輔助分析并設(shè)計引物(表1)。其中在引物RBSDV_s10-1 5’端引入Spe I、EcoRV雙酶切位點，在SCMV_cp-2引物5’端引入Sac I、RsrⅡ雙酶切位點；分別在RBSDV_s10-2和SCMV_cp-1引物5’端引入BamH I酶切位點。

1．4方法

1．4．1 目的基因的克隆 分別以RBSDV S10、SCMV CP基因的克隆質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性50s，60℃退火50 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳分離回收目的片段，將回收的目的片段和pMDl8-T Simple連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后送北京博尚公司測序。含有F10和FCP目的片段的重組質(zhì)粒分別命名為pMDl8-T-S10、pMDl8-T-CP。

1．4．2 RBSDV S10基因與SCMV CP基因的連接 質(zhì)粒pMDl8-T-SIO經(jīng)Spe I和BamH I雙酶切后得F10片段，質(zhì)粒pMDl8-T-CP經(jīng)BamHI和Sac I雙酶切后得FCP片段。F10片段和FCP片段按1：l比例混合后連接過夜。以連接產(chǎn)物為模板用引物RBSDV_s10-1和SCMV_cp-2進行PCR擴增獲得S10-cP片段。將其轉(zhuǎn)入pMDl8-T Simple，獲得重組質(zhì)粒pMDl8-T_s10-cp。

1．4．3植物表達載體的構(gòu)建亞利桑那大學(xué)開發(fā)的pMCGl61是專門用于玉米轉(zhuǎn)基因沉默的dsRNA植物雙元表達載體，載體中在一個內(nèi)含子兩側(cè)存在兩個多克隆位點，當(dāng)插入沉默靶標(biāo)基因時，可以用EcoRV和RsrⅡ酶切靶標(biāo)基因的PCR產(chǎn)物(上游引物5’端引入I和EcoRV雙酶切位點，下游引物5’端引入Sac I和RsrⅡ雙酶切位點)，正向插入該載體，用Spe I和Sac I酶切靶標(biāo)基因可以反向插入，這樣一次擴增靶標(biāo)基因兩次插入不同的多克隆位點，即可構(gòu)建反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因RNAi植物表達載體。將質(zhì)粒pM-CGl61、pMDl8-T_s10-cp分別用EcoRV和RsrⅡ雙酶切后連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，篩選陽性克隆，提純鑒定后獲得重組質(zhì)粒pMCGl61-C10。然后將質(zhì)粒pMCGl61-C10、pMDl8-T_s10-cp分別用Spe I和Sac I進行雙酶切和連接，篩選陽性克隆，經(jīng)鑒定得到最終的植物表達載體pMCGl61—CPl0(圖1)。

2 結(jié)果與分析

2．1 目的基因的克隆及篩選

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)期結(jié)果大小相符的片段(圖2)。擴增產(chǎn)物回收后與載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，分別篩選出3個陽性克隆，經(jīng)PCR檢測，插入片段在400bp左右與預(yù)期一致，表明該目的基因已連入克隆載體(圖3)。

2．2 S10一CP片段的擴增

以F10片段和FCP片段連接產(chǎn)物為模版，用引物RBSDV_sl和SCMV_cp-2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)l％瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，得到與預(yù)期結(jié)果大小相符的片段(圖4)?；厥漳康钠危缓筮B接到pMDl8一T Simple上，轉(zhuǎn)化DH5aα，提取陽性克隆中的質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后獲得重組質(zhì)粒pMDl8-T_s10-cp(圖5)。

2．3植物表達載體pMCGl61－CPl0的構(gòu)建2．3．1正向片段的連接及鑒定為了確認(rèn)重組質(zhì)粒pMCGl61－C10構(gòu)建的正確性，用EcoRV和RsrⅡ進行雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳可見大小為830 bp的目的片段(圖6)，表明正向片段已連入載體。2．3．2反向片段的連接及鑒定重組植物表達載體pMCGl61－CPl0用限制性內(nèi)切酶spe I和Sac I進行雙酶切，l％瓊脂糖凝膠電泳可見大小為830 bp的目的片段，表明RNAi載體已成功構(gòu)建(圖7)。

3、結(jié)論與討論

利用RNAi賦予植物對病毒抗性的原理，可以人為地將與病毒同源的dsRNA導(dǎo)入植物體內(nèi)，使其引發(fā)植物體內(nèi)的RNAi機制，對病毒致病基因進行特異的切割降解，阻止病毒的復(fù)制擴散，從而保護植物不受病毒的侵害。Wang等(2000)利用含有大麥黃矮病毒(Barley Yellow Dwarf Vi—rus．BYDV)PAV株系復(fù)制酶基因反向重復(fù)序列的載體，獲得了2個抗性可達免疫水平的大麥再生株系。Murry等(1993)首次將玉米矮花葉病毒的外殼蛋白基因?qū)胗衩?，獲得了抗MDMV的轉(zhuǎn)基因玉米植株。周小梅(2006)等用基因槍轟擊將SCMV外殼蛋白基因?qū)氲接衩鬃越幌稻C3、綜31，獲得對玉米矮花葉病具有一定抗性的轉(zhuǎn)基因玉米。白云鳳(2004)根據(jù)RNAi原理構(gòu)建了SCMV NIb基因反向重復(fù)序列表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NIb基因反向重復(fù)序列導(dǎo)入到玉米自交系，獲得高抗的轉(zhuǎn)基因植株，證實RNAi技術(shù)可成功用于抗玉米矮花葉病基因工程研究。

本研究通過克隆RBSDV SIO和SCMV CP的一部分保守序列，將其連接后獲得的$10-CP片段，分別以正向和反向插入dsRNA專用植物表達載體pMCGl61，獲得反向重復(fù)重組表達載體pM-CGl61-CPl0，為下一步通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法轉(zhuǎn)入玉米外植體，獲得雙抗玉米粗縮病和玉米矮花葉病的轉(zhuǎn)基因玉米奠定了基礎(chǔ)，對利用RNAi技術(shù)防治病毒病具有重要的意義。