摘要：研究了不同激素處理、不同花粉發(fā)育時(shí)期、不同低溫預(yù)處理和高溫預(yù)培養(yǎng)對(duì)丹參花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：最佳的培養(yǎng)基激素組合為Ms+2.O mg／L6-BA+O.2mg／LN從；單核靠邊期的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高；4℃低溫預(yù)處理2d最有助于愈傷組織發(fā)生；高溫預(yù)培養(yǎng)不利于愈傷組織誘導(dǎo)率的提高。

關(guān)鍵詞：丹參；花藥培養(yǎng)；愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào)：$567.530.353 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942(2010)08—0005—04

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salviamiltiorrhiza Bge.)干燥的根及根莖，主要有效成分為丹參酮IA、丹參酮ⅡA和隱丹參酮等脂溶性二萜類(lèi)化合物和丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶醛等酚酸類(lèi)化合物，為大宗常見(jiàn)中藥材，具有活血祛瘀，消腫止痛，養(yǎng)血安神的功效，現(xiàn)代藥理表明丹參在治療冠心病方面有顯著的療效。

隨著市場(chǎng)需求的增加，栽培丹參成為中藥丹參的主要來(lái)源?，F(xiàn)在丹參市場(chǎng)存在種質(zhì)混雜、質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)象，因此，有必要選育產(chǎn)量高、抗病性強(qiáng)、有效成分含量高的優(yōu)良丹參品種。采用常規(guī)育種方法，獲得純系需要3—5年的時(shí)間，利用花藥培養(yǎng)可誘導(dǎo)單倍體植株，經(jīng)加倍后可迅速獲得純系，縮短育種年限。

目前在很多作物上開(kāi)展了花藥培養(yǎng)方面的研究，在枸杞、百合、枇杷等中藥植物中也開(kāi)展了研究。有關(guān)丹參花藥培養(yǎng)方面的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究以丹參花藥為試驗(yàn)材料。對(duì)影響丹參花藥愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因子進(jìn)行了初步的探索，為丹參單倍體植株的獲得奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

l 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 2009年5月上中旬，在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園采集一年生丹參未開(kāi)放花蕾的花序，用醋酸洋紅染色，檢查花粉發(fā)育時(shí)期。選用花粉發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2試驗(yàn)方法

晴天午后采集未開(kāi)放花蕾，4℃低溫保存2 d(溫度預(yù)處理的材料除外)，清水沖洗30 min，75％酒精浸泡30 s，10％次氯酸鈉消毒15 min，再用無(wú)菌水沖洗3～5遍，無(wú)菌條件下剝?nèi)』ㄋ幗臃N于MS培養(yǎng)基上，接種密度為20個(gè)花藥／瓶，每處理接種9瓶。MS培養(yǎng)基添加蔗糖30 g／L，瓊脂6／L，pH值為5.8～6.0，120～125％下滅菌20min。花藥愈傷組織誘導(dǎo)期間進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃。30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.1 不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響將花藥接入不同激素配比的MS固體培養(yǎng)基中，觀察不同激素配比對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.2花藥不同發(fā)育時(shí)期對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響將不同發(fā)育時(shí)期的花藥分別接入MS+2.0m／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的固體培養(yǎng)基中，觀察不同發(fā)育時(shí)期對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.3不同低溫預(yù)處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 花蕾采摘后，進(jìn)行4'E低溫預(yù)處理O、1、2、3、4d，處理后將花藥接入MS+2.0mg/L6一BA+O.2m/L NAA的固體培養(yǎng)基中，觀察不同低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.4不同高溫預(yù)培養(yǎng)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 花蕾采摘后直接進(jìn)行處理，將花藥接入MS+2.O m／L 6一BA+0.2 m／LNAA的固體培養(yǎng)基中，放入35℃恒溫箱中預(yù)培養(yǎng)O、1、2、3、4 d，再置于25℃常溫下培養(yǎng)，觀察不同高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，6－BA、2，4－D、NAA為外源激素進(jìn)行正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)。從表1可以看出，添加激素能顯著提高花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導(dǎo)率，3種激素的極差大小依次為6一BA>2，4－D>NAA。不同的激素組合和濃度配比，對(duì)丹參愈傷組織的誘導(dǎo)效果不同，添加2.0 mg，／L 6－BA+0.2 mg／L NAA的培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了84.2％，與其它處理相比，差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明2.O mg／L 6一BA+O.2 m／LNAA是丹參花藥培養(yǎng)中誘導(dǎo)出愈較好的激素配比。

2.2花藥不同發(fā)育時(shí)期對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，小孢子處于4個(gè)發(fā)育時(shí)期的花藥都能誘導(dǎo)出愈傷組織，以單核靠邊期誘導(dǎo)率最高，為75.8％，與其它3個(gè)時(shí)期誘導(dǎo)率相比，差異顯著，因此認(rèn)為以單核靠邊期的花藥為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)較適宜。

2.3 不同低溫預(yù)處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將小孢子發(fā)育時(shí)期處于單核靠邊期的花蕾經(jīng)過(guò)低溫(4℃)預(yù)處理后，愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著(表3)。4℃處理1～2 d，能顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，處理2 d，誘導(dǎo)率達(dá)最高，與未經(jīng)低溫處理及低溫處理1 d的差異顯著。但隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)率迅速下降，低溫處理4 d的誘導(dǎo)率最低。說(shuō)明小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花藥進(jìn)行低溫預(yù)處理的適宜時(shí)間是2 d。

2.4不同高溫預(yù)培養(yǎng)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花藥接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行35℃高溫預(yù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨高溫預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率下降(表4)。經(jīng)高溫預(yù)培養(yǎng)后，花藥迅速變褐，轉(zhuǎn)到25\"C常溫下培養(yǎng)，比不經(jīng)高溫預(yù)培養(yǎng)的花藥產(chǎn)生愈傷組織慢且長(zhǎng)出的愈傷組織呈黃褐色，質(zhì)地松散。說(shuō)明高溫預(yù)培養(yǎng)不利于丹參花藥培養(yǎng)愈傷組織出愈率的提高。

3 討論與結(jié)論

外源激素對(duì)誘導(dǎo)花粉細(xì)胞的增殖和發(fā)育起著重要作用，不同作物、基因型及外植體對(duì)激素的種類(lèi)和配比有不同的要求。角豆樹(shù)添加0.5 mg／L 2，4-D+4 mg／L TDZ愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，小葉錦雞兒添加1.O mg／L 6-BA+3.O m／L 2。4一D組合對(duì)愈傷組織形成的效果最好，紫花苜蓿花藥誘導(dǎo)愈傷組織最佳的激素組合為O.5mg／L 2，4-D+0.2mg／LNAA+O.5 mg／L 6-BA+3 mg／L KT。本研究表明，添加6-BA、2，4-D、NAA三種激素組合均能誘導(dǎo)出愈傷組織，其中以6-BA作用最顯著。研究中發(fā)現(xiàn)添加2.O mg／L6-BA+2.O mg／L2，4-D的誘導(dǎo)率較高，但該組合的愈傷組織生長(zhǎng)迅速，為白色松散愈傷組織，貼近培養(yǎng)基處有毛狀根生長(zhǎng)，進(jìn)行分化培養(yǎng)時(shí)愈傷組織不能轉(zhuǎn)綠，仍然保持愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，可能2，4－D促進(jìn)丹參花藥愈傷組織細(xì)胞分裂作用強(qiáng)烈，致使轉(zhuǎn)接后的愈傷組織中仍保留有較高濃度的2，4－D。本研究表明，添加2.Om／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，并且在此培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的愈傷組織顏色淡黃、質(zhì)地緊密，轉(zhuǎn)到光下進(jìn)行分化培養(yǎng)時(shí)愈傷組織能夠迅速轉(zhuǎn)綠，表面生成綠色芽點(diǎn)，綠苗分化率較高。

小孢子發(fā)育時(shí)期與愈傷組織的誘導(dǎo)存在密切關(guān)系。不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子時(shí)期不同，對(duì)大多數(shù)植物而言，小孢子發(fā)育時(shí)期為單核中期至晚期的花藥容易形成愈傷組織。黃瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率最高的時(shí)期是單核中后期。百合花藥培養(yǎng)最適宜的時(shí)期是單核期。本研究表明丹參花藥培養(yǎng)的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期，進(jìn)一步證明了單核中期至晚期是大多數(shù)植物花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈的最好時(shí)期。

花蕾采集后進(jìn)行一定時(shí)間的低溫預(yù)處理，既緩解了接種時(shí)間，對(duì)大多數(shù)植物的花藥誘導(dǎo)也具有良好的促進(jìn)作用。但不同的植物，適合的低溫預(yù)處理時(shí)間不同。辣椒花蕾經(jīng)l～7 d低溫預(yù)處理后花藥愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于對(duì)照。二倍體馬鈴薯花蕾在4℃低溫預(yù)處理48 h后接種花藥，可明顯提高愈傷組織誘導(dǎo)率。本試驗(yàn)中接種的丹參花藥進(jìn)行低溫預(yù)處理后，誘導(dǎo)率明顯提高，以低溫處理2 d誘導(dǎo)率最高，之后，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)率下降。

花藥接種后先進(jìn)行一定時(shí)間的高溫預(yù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入25℃恒溫培養(yǎng)，能夠提高花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)率，一般以30—35~C處理l-3 d為宣。但丹參花藥接種后進(jìn)行35℃高溫預(yù)培養(yǎng)1 d后，花藥表面變褐，愈傷組織誘導(dǎo)率低于不經(jīng)高溫預(yù)培養(yǎng)的處理，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，花藥表面褐化加速，愈傷組織誘導(dǎo)率急劇下降。說(shuō)明不同植物對(duì)高溫處理的反應(yīng)不同，高溫處理對(duì)丹參花藥愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)有促進(jìn)作用。

通過(guò)對(duì)影響丹參花藥培養(yǎng)愈傷組織形成的各因子的研究，篩選出了各影響因子的最佳組合：將采摘花蕾經(jīng)過(guò)4℃低溫預(yù)處理2 d，選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花藥為外植體，接種在MS+3％蔗糖+O.6％瓊脂+2.O mg／L 6－BA+O.2 mg／L NAA的培養(yǎng)基上，最有利于丹參花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。