中圖分類號(hào)：S854.4⁺3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X(2010)12-0004-03

7 核酸序列分析技術(shù)

核酸是生命的遺傳物質(zhì)、遺傳信息存在于4種單核苷酸(A，G，C，T)按不同順序連接而成的核酸分子中，迅速準(zhǔn)確地解讀決定生命性狀的密碼，測(cè)定基因組的核酸序列，對(duì)于識(shí)別病原，揭示疫病變化規(guī)律是其他任何方法都無法比擬的，但它也是最煩瑣和最復(fù)雜的檢測(cè)技術(shù)，目前在動(dòng)物檢疫中尚較少采用，但有時(shí)是必須且正日益變得常用。

7.1 技術(shù)原理

目前應(yīng)用最多的快速測(cè)序技術(shù)是Sanger等(1997)提出的雙脫氧鏈終止法。其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長(zhǎng)，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳以分離長(zhǎng)短不一的核酸片段(長(zhǎng)度相鄰者僅差一個(gè)堿基)，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成的堿基排列順序。

7.2 研究進(jìn)展

7.2.1 幾種快速獲取模板的方法

單鏈?zhǔn)删w系統(tǒng)：利用克隆載體M13噬菌體浸染大腸桿菌，在細(xì)菌細(xì)胞噬菌體基因組以復(fù)制型雙鏈DNA存在，并經(jīng)滾環(huán)式復(fù)制產(chǎn)生子代噬菌體正鏈DNA，同時(shí)合成有關(guān)蛋白，裝配后釋放到細(xì)胞外。成熟的M13噬菌體含單鏈DNA，經(jīng)克隆的篩選、抽提純化，得到所需模板。

雜交質(zhì)粒系統(tǒng)：此系統(tǒng)除具M(jìn)13系統(tǒng)的功能外，還能作為表達(dá)載體直接用于DNA序列分析和基因表達(dá)研究。

直接利用RNA進(jìn)行序列測(cè)定：在雜交質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)插入一段能被噬菌體RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子，在噬菌體RNA聚合酶的作用下，在體外將克隆的外源雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄為單鏈的RNA，以RNA為模板，與引物退火后，在反轉(zhuǎn)錄酶(如AMV)作用下，按雙脫氧鏈終止法步驟進(jìn)行序列分析。

PCR技術(shù)的采用：PCR技術(shù)的出現(xiàn)，使序列分析用DNA模板的制備更加方便。①例如用PCR法合成雙鏈DNA片段，直接用雙鏈進(jìn)行測(cè)序。②在PCR擴(kuò)增時(shí)，兩個(gè)引物之一的5，端生物素化，擴(kuò)增后將DNA變性，通過親和素柱，分離5’端含生物素的單鏈。③利用不對(duì)稱PCR，按1：50匹配兩引物含量，產(chǎn)生單鏈DNA。④GAMTS法，在兩個(gè)PCR引物之一的5’端連接噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，這樣經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA片段的一端就帶上了該啟動(dòng)子序列。然后以擴(kuò)增出的雙鏈DNA為模板，在噬菌體RNA聚合酶作用下轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA。再以單鏈RNA為模板進(jìn)行序列分析。

7.2.2 采用高分辨率的凝膠電泳技術(shù)

采用薄膠：凝膠厚度減少到0.5mm或0.1mm，樣品泳動(dòng)加快，自顯影時(shí)減少B粒子在凝膠中的散射，提高分辨率。

采用梯度膠：包括離子梯度和濃度梯度，使DNA片段泳動(dòng)均勻，大小不同而又很相近的大片段更易拉開距離。

采用鯊魚齒梳：使相鄰泳道相互靠近，不但在顯影圖上更易判定相鄰帶的上下關(guān)系，而且可以增加每板凝膠的泳道數(shù)目。

7.2.3 DNA序列分析自動(dòng)化

放射白顯影自動(dòng)讀譜儀：在電泳裝置中裝一個(gè)高靈敏度放射性探測(cè)儀，在電泳過程中將結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，獲得分析結(jié)果。

用熒光標(biāo)記引物或熒光標(biāo)記ddNTP：可在電泳過程中以激光掃描裝置識(shí)別DNA條帶，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后得到序列分析結(jié)果。此法適宜大量樣品的測(cè)序。

7.3 Sancier脫氧鏈終止法(酶法)測(cè)序程序

操作程序是按DNA復(fù)制和RNA反轉(zhuǎn)錄的原理設(shè)計(jì)的。

分離待測(cè)核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。

在4只試管中加入適當(dāng)?shù)囊?、模板?種dNTP，包括放射性標(biāo)記dATP，例如α-32P dATP和DNA聚合酶(如以RNA為模板，則用反轉(zhuǎn)錄酶)，再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸)。

與單鏈模板(如以雙鏈作模板，要做變性處理)結(jié)合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進(jìn)行延伸反應(yīng)，32P隨著引物延長(zhǎng)摻入到新合成鏈中。當(dāng)ddNTP摻入時(shí)，由于它在3’端位置沒有羥基，故不與一個(gè)dNTP結(jié)合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列沒長(zhǎng)度的新的DNA鏈。

用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)分離4只反應(yīng)管中的反應(yīng)產(chǎn)物。由于每一反應(yīng)管中只加一種ddNTP(如ddATP)，則該管中各種長(zhǎng)度的DNA都終止于該種堿基(如A)處。讀出與模板鏈互補(bǔ)的新鏈序列。

放射自顯影。根據(jù)四泳道的編號(hào)和每個(gè)泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補(bǔ)的新鏈序列。

7.4 雙脫氧測(cè)序的示例及具體操作步驟

變性雙鏈模板的制備：

材料：riffs葡萄糖緩沖液(20mmol／L Tris-HCloH8，0.10mmol／LEDTA，50mmol／L葡萄糖)，I％SDS，0.2mol／L NaOH，異丙醇，TE緩沖液pH8，0，4mol／LHCl，冷70％無水乙醇，2mol／L NaOH，2mmol／L ED—TA。

配制方法：取1.6mL處于對(duì)數(shù)生產(chǎn)期的培養(yǎng)菌液(含有待測(cè)病毒核酸的重組質(zhì)粒模板)，離心除去上清液后，用150μL Tris葡萄糖緩沖液重懸菌團(tuán)，在室溫下放置5min；加入300mL的I％SDS，0.2mol／LNaOH，顛倒混合約15次，在室溫下放置15rain，加入225mL 3mol／L醋酸鈉(pH4.5)，顛倒約15次混合，在冰浴中放置45min，然后離心5min；將650mL上清液轉(zhuǎn)移至一支新管中，加入650μL異丙醇，混合后在室溫下放置10min，離心5min后棄去異丙醇，抽真空干燥沉淀；用125μL TE(pH8.0)重新溶解DNA，加入375poL的4mol／L HCl，冰浴20min后，于4℃下離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移至一支新管中用飽和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍體積的異丙醇，在室溫下沉淀30min，離心5min，棄去上清液；用冰冷的70％乙醇洗沉淀，離心5min，棄去上清液并干燥，用50μL TE緩沖液重新溶解沉淀。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA含量：取0.2g質(zhì)粒DNA，并將體積調(diào)至9μL，加入μL 2mol／L NaOH，2mmol／LEDTA，在室溫下放置5min，加入2μL 30mol／L醋酸鈉(pH4.5)和8μL水；加入6μL冰冷無水乙醇，混合后在干冰／乙醇浴中放置15min，在4℃下離心5min，小心地棄去上清液，用冰冷的70％乙醇洗沉淀，離心5rain并小心地棄去上清液，真空抽干沉淀，并用TE緩沖液重新溶解沉淀。

延伸和終止反應(yīng)：以利用T7 DNA聚合酶進(jìn)行的雙脫氧鏈終止反應(yīng)為例。

材料：變性的雙鏈DNA模板(溶解在TE緩沖液中)，0.5pmol／L寡核苷酸引物(溶解在TE中，-20℃貯存)，5×測(cè)序緩沖液(200mmol／L Tris pH7.5，50mmol／L M~C12，-20℃貯存)，0.1mol／L DTT(當(dāng)月新配，-20℃貯存)，15mol／L的3種dNTP混合物(缺dATP)，1000-1500mmo／L α-32P dATP(在20℃F達(dá)4-6周)，修飾的T7 DNA聚合酶，標(biāo)準(zhǔn)酶稀釋溶液(20mmol／L Tris-HCl pH7.5，0.5m／mL BSA，10retool／L-巰基乙醇，4℃貯存)，終止混合物，甲酰胺上樣緩沖液(0.2mL 0.5mol／L EDTA oH8.0，10mg溴酚藍(lán)，10mg二甲苯，10mL甲酰胺)。

配制方法：取4支0.5mL離心管，標(biāo)上G、A、T、C，每管加入7μL變性的雙鏈DNA(模板9分別為1μg和21xg)，如1μL寡核苷酸引物和21xL 5×測(cè)序緩沖液混合，65℃保溫2min，在室溫下冷卻30rain；每管加入1μL 0.1moL／L DTr.2μL 1 06mOL／L 4種dNTP混合物。0.5μL α-32P dATP和2tzL(2IU)修飾的T7 DNA多聚酶混合物，在室溫下放置5min；按標(biāo)記每管分別加入3tzL 4種ddNTP終止混合物的一種：短促離心后，在37℃下保溫5min；加入5μL甲酰胺上樣緩沖液，上樣前在80℃下加熱2min，并迅速置于冰浴上，每個(gè)樣品取3μL，上樣電泳。

測(cè)序反應(yīng)物電泳和序列讀?。喊雌胀ň郾０纺z制備方法制作梯度膠；按G、A、T、C次序加入每種樣品，在G、A和T種泳道上樣如1μL，而在C泳道上樣1.6μL；上樣完畢加壓1700V電泳，根據(jù)樣品中溴酚藍(lán)和二甲苯青染料遷移情況確定電泳時(shí)間；電泳完畢，在10℃冰醋酸中漂洗30min脫去尿素：在60℃或80℃干燥30min，放射自顯影讀取序列。

8 DNA芯片技術(shù)(DNAchips)

DNA傳統(tǒng)的測(cè)序方法是Maxam和Gilbert的化學(xué)法以及Sanger的末端鏈終止法，但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來一種全新的DNA測(cè)序方法，雜交測(cè)序以及基于雜交測(cè)序發(fā)展起來的DNA芯片或叫基因芯片的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。DNA芯片能在一次試驗(yàn)中同時(shí)自動(dòng)、快速、敏感地檢測(cè)數(shù)千條序列，而且獲得信息高度特異、穩(wěn)定，被譽(yù)為遺傳信息方面革命性的里程碑。它可用于基因多態(tài)性分析、突變的檢測(cè)、病原的檢測(cè)等，DNA芯片技術(shù)是當(dāng)今世界基因序列分析、基因檢測(cè)的萬能鑰匙，該技術(shù)的發(fā)展必將極大地加速診斷技術(shù)的發(fā)展，使得診斷技術(shù)簡(jiǎn)單化、自動(dòng)化與現(xiàn)代化。

8.1 DNA芯片的基本原理

DNA芯片的基礎(chǔ)是雜交測(cè)序，其基本原理是：任何線狀的DNA或RNA序列均可被測(cè)序：反過來，假如我們把原序列中的所有這些錯(cuò)落重疊的亞序列全部檢測(cè)出來，就可以據(jù)此重新組建出原序列。對(duì)于一個(gè)未知DNA序列，可以用人工合成的、已知序列的所有可能的N體寡核苷酸探針與之雜交(在寡核苷酸，G、C、T、A四者自由組合而成所有可能的序列共有4⁸=65536)。通過對(duì)雜交的檢測(cè)。檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而獲知靶DNA中的所有亞序列，組合分析后者(由電腦軟件進(jìn)行)即可重構(gòu)靶DNA中的序列，此即SBH。前人的試驗(yàn)充分證明了SBH測(cè)序的能力。SBH可分成兩種類型：I型，即靶DNA被固定，而被熒光素標(biāo)記的寡核苷酸探針一個(gè)一個(gè)與之雜交，最后檢出所有能與靶DNA雜交的ODT探針：Ⅱ型，即靶DNA被標(biāo)記而ODT探針被同定。根據(jù)Ⅱ型SBH，采用特殊工藝在一塊小的基板上定位合成所有可能的N體ODT探針而形成一個(gè)高密、微化的寡核苷酸陣列(ODTA)，這就是DNA芯片。對(duì)于陣列上的任一ODT，它的序列都是已知的，且呈一對(duì)一的關(guān)系。當(dāng)加入經(jīng)PCR擴(kuò)增的、限制性內(nèi)切酶處理和熒光索標(biāo)記的一小滴單鏈靶DNA后，它將以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與芯片上的所有互補(bǔ)的ODT探針雜交，所有這些雜交構(gòu)成了一個(gè)“雜交模式”，即芯片上的所有雜交信號(hào)所在位點(diǎn)的綜合，它間接反映靶DNA的所有亞序列，計(jì)算機(jī)通過對(duì)這個(gè)“雜交模式”的分析而重建DNA序列。由于雜交反應(yīng)是平行進(jìn)行的。故可在同一芯片上一次同時(shí)分析多條不同靶DNA序列。

8.2 DNA芯片的制作

DNA芯片技術(shù)的關(guān)鍵在于高密、微化的寡核苷酸陣列(ODTA)的制作。PEASE等人于1994年創(chuàng)造的光導(dǎo)ODTA化學(xué)合成法，為DNA芯片技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。該合成法有三項(xiàng)基本技術(shù)：固相化學(xué)，可感光保護(hù)基團(tuán)和照相平版印刷術(shù)，后者是該合成系統(tǒng)的基礎(chǔ)。

合成反應(yīng)步驟如下：連接有可感光保護(hù)基團(tuán)x的羥基，通過連接者覆蓋于固相基板表面(如玻璃基板)，X是可感光保護(hù)基團(tuán)。如NVOC、X與羥基連接時(shí)。則羥基不能與加入的脫氧核苷酸發(fā)生聚合作用，但曝光可移去X(即光去保護(hù))，去掉X的羥基成為有功能的自由羥基，而可與脫氧核苷酸聚合。

加入的反應(yīng)物是3’phosphoramidites激活的、5’端可感光保護(hù)的N-乙酰-脫氧核苷對(duì)反應(yīng)起激活作用。合成時(shí)，光通過光遮板的一定大小的小孔照射到基板表面的目標(biāo)合成部位，曝光的部位發(fā)生光去保護(hù)，X被移去，自由羥基暴露，此時(shí)加入第一批反應(yīng)物，如含了的反應(yīng)物，即能與曝光部位的自由羥基發(fā)生化合反應(yīng)，第一個(gè)反應(yīng)物被嫁接到目標(biāo)位置上。然后，光通過第二個(gè)遮光板，在新的位置嫁接新的反應(yīng)物。由于加入的反應(yīng)物也是含x的，故再次被曝光時(shí)，X又被移去，已嫁接上的脫氧核苷酸的自由羥基暴露，可與新加入的反應(yīng)物化合，從而使寡核苷酸鏈延長(zhǎng)。這樣隨著反應(yīng)重復(fù)，合成不斷進(jìn)行，最后當(dāng)所需ODT均合成完畢后，對(duì)反應(yīng)基板進(jìn)行無遮板的汞光普照，去除所有X，即得到需要的ODTA，這里，光照模式(iIlumination pattern)和反應(yīng)物的加入序列決定了合成產(chǎn)物的序列以及在基板上的位置，采用組合合成策略(combinatorial synthesis strategies)使得少的化學(xué)步驟能合成最大數(shù)量的復(fù)合物，如要合成T、C、G、A四個(gè)成分所有序列組合的四聚體?？刹捎孟铝胁呗浴?/p>

整個(gè)反應(yīng)需4個(gè)回合，每回合四輪。第l回合自左向右4均分基板，以AGCT的順序嫁接核苷酸：第2回合同樣以AGCT的順序，自下而上在前面合成的基礎(chǔ)上再接上一核苷酸，這樣基板上就形成了16個(gè)單元；第3、4回合即在這每個(gè)單元上繼續(xù)以上述模式嫁接核苷酸。合成結(jié)束時(shí)，44種四聚體在44次化合反應(yīng)全部合成，而且每一四聚體的序列、位置均明確知道。用該策略合成一塊含所有65 536個(gè)ODT的芯片只需8h。

由上可知，基板上曝光點(diǎn)越細(xì)、越密集，合成的ODTA密度越高，曝光點(diǎn)大小直接取決于遮板透光孔徑的大小，而后者因?yàn)檠苌涠罱K受限于所用光的波長(zhǎng)。1994年P(guān)EASE的技術(shù)合成65 536個(gè)ODT探針的芯片只需0.64cm²，而近年常用的“半導(dǎo)體光阻”技術(shù)可使ODTA密度達(dá)到10⁶-10⁷位點(diǎn)／cm²。

8.3 芯片雜交的檢測(cè)方法

靶DNA-ODT探針雜交的檢測(cè)方法很多，而最多被采用的是熒光顯影法，簡(jiǎn)要過程是：靶DNA先被熒光素標(biāo)記，待與芯片充分雜交后沖洗，用連有“電荷偶連裝置照相機(jī)”的熒光顯微鏡分析雜交的熒光信號(hào)模式，后者經(jīng)計(jì)算機(jī)分析后重建靶DNA序列。激光共聚焦熒光檢測(cè)是近年廣為應(yīng)用的芯片雜交檢測(cè)手段，簡(jiǎn)述如下：

待檢品儲(chǔ)器中加滿熒光素標(biāo)記的靶DNA溶液，芯片倒置其上，激光從芯片背面射入，聚焦于芯片與靶DNA溶液的相互作用面，這樣能與芯片雜交的DNA上的熒光素被激發(fā)發(fā)光，后者經(jīng)棱鏡后剛好聚焦于空間共聚焦小孔，故能有效通過該小孔而被探測(cè)器檢測(cè)。而焦點(diǎn)外溶液中的熒光信號(hào)因不能聚焦于共聚焦小孔，不能有效通過，故檢測(cè)不到。這使得沖洗這一步被省去，在數(shù)分鐘內(nèi)即可得到一個(gè)二維雜交信號(hào)模式。并且通過改變系統(tǒng)溫度還可獲得雜交的熱動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。

計(jì)算機(jī)軟件的改造使序列閱讀更加直觀。另外，若把電子微芯片與CCD結(jié)合，作成微芯片CCD，直接放于DNA芯片的下面記錄雜交模式，即可使熒光顯微鏡都不再需要。

8.4 芯片技術(shù)的問題及其進(jìn)展

DNA芯片技術(shù)存在的問題大致可概括為以下3點(diǎn)，隨著這些問題的解決，芯片技術(shù)本身也不斷發(fā)展。①靶DNA與ODT探針的雜交存在著錯(cuò)配、未配的情況；②靶DNA自身二級(jí)甚至三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成：③靶DNA存在串聯(lián)的重復(fù)序列會(huì)使計(jì)算機(jī)重構(gòu)序列時(shí)產(chǎn)生分支點(diǎn)而無法排序。這些問題已逐步解決。DNA的出現(xiàn)使DNA芯片由0DTA擴(kuò)展到0DTA+DNA。而“生物芯片”則是一個(gè)包含DNA芯片的范疇更廣的概念。

據(jù)以上介紹，基于SBH原理及現(xiàn)代工藝的DNA芯片技術(shù)，由于雜交反應(yīng)的平行性使得它能在一次試驗(yàn)中自動(dòng)同時(shí)、快速、敏感地檢測(cè)數(shù)千條序列，而且獲得的序列信息高度特異、穩(wěn)定，被譽(yù)為遺傳信息方面革命性的里程碑，可以在病原檢測(cè)、基因突變的檢測(cè)及對(duì)經(jīng)傳統(tǒng)方法已經(jīng)測(cè)得的序列進(jìn)行復(fù)核?？傊?0世紀(jì)末發(fā)展起來的DNA芯片技術(shù)幾乎是當(dāng)今基因序列分析、基因檢測(cè)的萬能鑰匙，該技術(shù)的發(fā)展及廣泛應(yīng)用必將加速與提高對(duì)疾病診斷與防制的水平。