張 林,黃 勇,沈興家,劉 利,趙衛(wèi)國(guó),強(qiáng) 勝

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院雜草研究室,江蘇 南京 210095；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,江蘇 鎮(zhèn)江 212018；

3.江蘇科技大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212018；4.國(guó)家農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,江蘇 鎮(zhèn)江 212018)

在中國(guó),桑 (MorusalbaL.)的栽培歷史悠久,遺傳資源十分豐富。根據(jù)地理分布可將中國(guó)桑地方品種分為 8個(gè)不同的生態(tài)類(lèi)型,每個(gè)生態(tài)類(lèi)型均有各自的特征,在枝條形態(tài)、葉形大小、發(fā)芽期、抗逆性等方面都有一定的差異。黃河下游區(qū)域栽培的魯桑〔Morusalbavar.multicaulis(Perro tt.)Loud.〕是 8個(gè)生態(tài)類(lèi)型之一,是中國(guó)北方主蠶區(qū)的代表性桑品種,也是中國(guó)桑品種資源庫(kù)的重要組成部分[1-2],主要分布在山東省蠶區(qū),也包括河北省的部分蠶區(qū)。

ISSR分子標(biāo)記具有簡(jiǎn)單和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于桑樹(shù)的分子生物學(xué)研究。其原理是根據(jù)植物中廣泛存在簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)的特點(diǎn),利用在植物基因組中常出現(xiàn)的 SSR本身設(shè)計(jì)引物,用于擴(kuò)增的引物通常具有 16～18個(gè)堿基,一般由 1～4個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個(gè)非重復(fù)的錨定堿基組成,無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序。目前已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。

目前,有關(guān)桑樹(shù) ISSR分子標(biāo)記的研究較多,研究方向主要集中于桑樹(shù)遺傳多樣性和親緣關(guān)系方面,研究對(duì)象主要是不同品種以及不同生態(tài)類(lèi)型。V ijayan等[3-5]采用 ISSR分子標(biāo)記對(duì)印度的桑屬 (MorusL.)栽培品種、高產(chǎn)品種及野生種進(jìn)行了遺傳多樣性分析；Awasthi等[6]采用 ISSR分子標(biāo)記對(duì)桑樹(shù)的部分栽培品種進(jìn)行了親緣關(guān)系分析,研究結(jié)果顯示品種間差異明顯；趙衛(wèi)國(guó)等[7-14]利用 ISSR分子標(biāo)記對(duì)桑樹(shù)的栽培種和野生種、二倍體、同源四倍體、選育品種、芽變類(lèi)型以及 8個(gè)不同生態(tài)類(lèi)型進(jìn)行了遺傳多樣性分析及分子系統(tǒng)學(xué)研究；Kar等[15]利用與某些生化性狀有關(guān)的 ISSR標(biāo)記分析了印度桑樹(shù)遺傳資源的遺傳變異和親緣關(guān)系。但迄今為止,對(duì)桑樹(shù)同一生態(tài)類(lèi)型不同地方品種間親緣關(guān)系的研究卻較少,對(duì)魯桑地方品種遺傳多樣性的研究則未見(jiàn)報(bào)道。

作者利用 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黃河下游區(qū)域(河北省和山東省)46個(gè)魯桑地方品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析,以期在分子水平上研究魯桑不同地方品種的遺傳關(guān)系,為魯桑種質(zhì)資源DNA指紋圖譜的建立及品種鑒定提供科學(xué)依據(jù)。這對(duì)于魯桑種質(zhì)資源的保護(hù)、重要農(nóng)藝性狀基因的發(fā)掘和利用都具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的 46個(gè)魯桑地方品種均種植于江蘇鎮(zhèn)江的國(guó)家桑樹(shù)資源圃,原產(chǎn)地及各地方品種的主要性狀見(jiàn)表 1。采集當(dāng)年生嫩葉供試。

實(shí)驗(yàn)使用的 ISSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,TaqDNA聚合酶、PCR buffer、dNTPs以及 DL2000 m arker均購(gòu)自寶生物工程 (大連)有限公司。

1.2 方法

隨機(jī)采集各地方品種當(dāng)年生新鮮嫩葉,用 CTAB法[16]提取總DNA,并置于 -70℃條件下保存、備用。用魯桑品種‘大雞冠’的總DNA對(duì)23個(gè) ISSR引物進(jìn)行初步篩選,選擇擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的 15個(gè)引物,用于 46個(gè)魯桑地方品種總DNA的 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)。

ISSR-PCR反應(yīng)體系總體積為 15μL,包括 10 ng模板 DNA、0.7μL引物 (10 ng·μL-1)、1 UTaqDNA聚合酶、1.5μL 10×PCR buffer和 0.25μLdNTPs(200μmo l·L-1),用純水補(bǔ)足至 15μL。

ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 2 m in；然后于 94℃變性 40 s、40℃～60℃退火 45 s(根據(jù)每個(gè)引物的 Tm值設(shè)定具體退火溫度)、72℃延伸90 s,共 36個(gè)循環(huán)反應(yīng)；最后于 72℃延伸 7m in。擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃條件下保存。

ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 1％的瓊脂糖凝膠(含質(zhì)量濃度 0.5μg·mL-1EB)進(jìn)行電泳檢測(cè),并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。

表 1 供試 46個(gè)魯桑地方品種的原產(chǎn)地及主要性狀Tab le 1 The or ig in sand m a in characters of for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)L oud.for tested

1.3 數(shù)據(jù)分析

按照清晰易辨、重復(fù)、穩(wěn)定的原則對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì),有條帶的記為“1”、同一位置沒(méi)有條帶的則記為“0”,以此形成 0、1數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)和其中的多態(tài)性條帶數(shù),并計(jì)算多態(tài)性條帶百分率。按照 Nei等[17]的方法,利用 Popgene 3.0 (PHYL IP 3.5版本)系統(tǒng)分析軟件計(jì)算各地方品種間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離,并采用類(lèi)平均數(shù)聚類(lèi)方法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析,構(gòu)建魯桑地方品種間的遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)過(guò)初篩實(shí)驗(yàn),從 23個(gè) ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的 15個(gè)引物用于 46個(gè)魯桑地方品種指紋圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析,引物序列和擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表 2,引物ISSR04的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖 1。

由表 2可見(jiàn),在篩選出的 15個(gè)引物中,12個(gè)引物(ISSR03～I(xiàn)SSR07和 ISSR09～I(xiàn)SSR15)含有 2個(gè)堿基的微衛(wèi)星重復(fù)單位,2個(gè)引物 (ISSR02和 ISSR08)含有 3個(gè)堿基的微衛(wèi)星重復(fù)單位,1個(gè)引物 (ISSR01)含有 4個(gè)堿基的微衛(wèi)星重復(fù)單位。通過(guò) PCR反應(yīng),共擴(kuò)增出 109條清晰條帶,其中多態(tài)性條帶 81條,多態(tài)性條帶百分率為 74.31％,平均每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為 7.3條,平均每個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)為 5.4條。不同引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為 5～11條,引物 ISSR11擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少,僅有 5條；引物 ISSR05擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多,為 11條。各引物擴(kuò)增出的片段大小為 250～2 000 bp(圖 1)。

表2 用于46個(gè)魯桑地方品種總DNA ISSR標(biāo)記分析的引物序列及擴(kuò)增結(jié)果Tab le 2 Pr im er sequence and am p lifica tion resu lts of ISSR m arker ana lysis of tota l DNA from for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var. m u lticau lis(Perrott.)Loud.

2.2 基于 ISSR標(biāo)記的聚類(lèi)分析結(jié)果

以 46個(gè)魯桑地方品種總DNA的 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的 81條多態(tài)性條帶為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),計(jì)算各地方品種間的遺傳相似系數(shù),結(jié)果表明,46個(gè)地方品種間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為 0.602～0.898,平均遺傳相似系數(shù)為 0.750。由于實(shí)驗(yàn)所涉及的魯桑地方品種均為山東省和河北省典型的地方品種,這 2個(gè)省份毗鄰且不排除相互引種的可能性,因此,計(jì)算出的平均遺傳相似系數(shù)相對(duì)偏大。其中,品種‘萊蕪接?！汀嗤┥！约捌贩N‘小雞冠’和‘三岔黃魯’間的遺傳相似系數(shù)最大,為 0.898,表明它們之間的遺傳距離最小,親緣關(guān)系很近；來(lái)源于河北的品種‘冀豐’和山東的品種‘新泰打?！倪z傳相似系數(shù)最小,僅為0.602,表明二者間的遺傳距離最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

基于魯桑不同地方品種間的遺傳相似系數(shù)、采用UPGMA法進(jìn)行了聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖 2。由圖 2可見(jiàn),在遺傳相似系數(shù)約 0.637處,供試的 46個(gè)魯桑地方品種 (40個(gè)為山東地方品種,6個(gè)為河北地方品種)被劃分成 2大類(lèi)。其中,品種‘冀豐’和‘冀黃魯選’為河北省地方品種,且均為雌株,被聚在一起成為第 1大類(lèi)；其余 44個(gè)地方品種聚為第 2大類(lèi),該大類(lèi)包括 40個(gè)來(lái)自山東省的魯桑地方品種和 4個(gè)來(lái)自河北省的魯桑地方品種。綜合各地方品種的產(chǎn)地、性狀及遺傳相似性系數(shù),可進(jìn)一步將第 2大類(lèi)的 44個(gè)地方品種細(xì)分為9個(gè)亞類(lèi),分別為A、B、C、D、E、F、G、H和 I亞類(lèi)。其中,A、E、F、G、H和 I亞類(lèi)共包含了36個(gè)地方品種,全部為原產(chǎn)山東省的魯桑地方品種,占供試的山東魯桑地方品種數(shù)(40個(gè))的 90％；劃歸B、C和D亞類(lèi)的地方品種均包含了分別來(lái)自山東省和河北省的地方品種,其中,B亞類(lèi)包含了來(lái)自河北深縣的品種‘碗?！蛠?lái)自山東蒙陰的品種‘紅條擗?！?C亞類(lèi)包含了來(lái)自河北寬城的品種‘桲欏?！?lái)自河北深縣的品種‘深縣黃魯’和來(lái)自山東青州的品種‘益都大白條’,D亞類(lèi)包含了來(lái)自河北深縣的品種‘大碗?！约皝?lái)自山東臨朐的品種‘選 792’和‘黃魯頭’；此外,E亞類(lèi)較為特殊,僅包含 1個(gè)品種,即產(chǎn)自山東蒙陰的品種‘白條擗桑’,是 46個(gè)供試品種中惟一的 1個(gè)三倍體品種,在遺傳特性上具有明顯的特殊性。

圖1 引物 ISSR04對(duì)46個(gè)魯桑地方品種總DNA的 ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.1 ISSR am p lifica tion pa ttern of tota lDNA from for ty-six loca l var ietiesofM o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)Loud.am p lified by pr im er ISSR04

圖2 基于46個(gè)魯桑地方品種總DNA ISSR標(biāo)記分析的 UPGM A聚類(lèi)圖F ig.2 UPGM A cluster dendrogram based on ISSRm arker ana lysis of tota lDNA from for ty-six loca l var ieties of M o rus a lba var.m u lticau lis(Perrott.)Loud.

3 討論和結(jié)論

買(mǎi)買(mǎi)提依明等[18]對(duì) 16個(gè)新疆地方桑樹(shù)品種資源(包括 2個(gè)引進(jìn)的品種)進(jìn)行了 RAPD標(biāo)記研究,發(fā)現(xiàn)新疆特有的桑樹(shù)品種資源藥桑與引進(jìn)的品種‘西慶1號(hào)’和‘西慶 2號(hào)’間的指紋圖譜差異較大,表明不同桑樹(shù)地方品種的遺傳關(guān)系與其地理分布具有一定的相關(guān)性。在本研究中,利用 ISSR分子標(biāo)記對(duì) 46個(gè)魯桑地方品種進(jìn)行進(jìn)一步的劃分,結(jié)果顯示,魯桑地方品種的各大類(lèi)和各亞類(lèi)與各地方品種的地理分布具有一定的關(guān)系,地理位置相近的品種遺傳相似系數(shù)較大,一般被聚在一起。例如,來(lái)自山東各地的 40個(gè)魯桑地方品種均被聚入第 2大類(lèi)中,形態(tài)特征相似的魯桑地方品種聚為同一個(gè)亞類(lèi),且很多來(lái)自同一個(gè)縣。其中,A亞類(lèi)中的‘大雞冠’和‘小雞冠’都為來(lái)自山東臨朐的魯桑地方品種,均為雌雄同株；D亞類(lèi)中的‘選 792’和‘黃魯頭’以及 G亞類(lèi)中的‘雞冠一生子’和‘黑魯?！捕紴閬?lái)自山東臨朐的魯桑地方品種,且形態(tài)特征相似；I亞類(lèi)中的‘小黃?！汀绿┐蛏！簿鶠閬?lái)自山東新泰的魯桑地方品種。但B、C和D亞類(lèi)分別由來(lái)自山東和河北的魯桑地方品種組成,這一現(xiàn)象很可能與不同產(chǎn)地間的相互引種有關(guān)。

使用 15個(gè) ISSR引物對(duì) 46個(gè)來(lái)自山東和河北的魯桑地方品種總DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),共擴(kuò)增出 81條多態(tài)性條帶,多態(tài)性條帶百分率為 74.31％,說(shuō)明供試的魯桑地方品種間具有豐富的遺傳多樣性。46個(gè)魯桑地方品種間的遺傳相似系數(shù)為 0.602～0.898,數(shù)值偏大,這可能是由于河北和山東兩省距離較近,且可能存在相互引種的現(xiàn)象。基于 ISSR分子標(biāo)記對(duì)供試的 46個(gè)魯桑地方品種進(jìn)行聚類(lèi)分析,獲得的分組結(jié)果與不同品種的地理分布有一定的相關(guān)性,說(shuō)明魯桑地方品種間的親緣關(guān)系與地理分布的遠(yuǎn)近有關(guān)。

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