摘要：目的：為提高五味子藥材的質(zhì)量控制水平，建立北五味子藥材的HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行方法學(xué)考察。方法：用HPLC方法，在檢測(cè)波長(zhǎng)250nm下，以五味子醇甲為對(duì)照品，采用甲醇(A)、水(B)二元流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫建立北五味子藥材的HPLC指紋圖譜。結(jié)果：在檢測(cè)波長(zhǎng)250nm下，北五味子藥材共有8個(gè)共有色譜峰，且以甲醇(A)、水(B)二元流動(dòng)相梯度洗脫的條件下，供試品出峰較多，色譜峰分離度良好，所建立的指紋圖譜更具代表性。另對(duì)10個(gè)批次五味子藥材指紋圖譜進(jìn)行了相關(guān)性考察及聚類分析，結(jié)果表明共有色譜峰相似系數(shù)均在0.999以上，10批樣品間具有較高的相似度，可以繼續(xù)擴(kuò)大樣品范圍、數(shù)量?？捎糜诮⒈蔽逦蹲拥牡赖厮幉牡腍PLC指紋圖譜模型并提高五味子藥材的質(zhì)量控制水平。結(jié)論：此方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，且簡(jiǎn)便可行，可用于五味子藥材的質(zhì)量控制；
　　關(guān)鍵詞：北五味子；HPLC指紋圖譜；相似度；聚類分析
　　中圖分類號(hào)：R284.1
　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
　　文章編號(hào)：1007－2349(2010)06－0058－04
　　
　　中藥指紋圖譜是以系統(tǒng)的化學(xué)成分或藥理學(xué)研究為基礎(chǔ)，采用化學(xué)測(cè)定或基因鑒定得到某種或某產(chǎn)地中藥(制劑)所共有的、具有特異性的組分群體(某類或數(shù)類成分)特征圖譜或圖象。利用現(xiàn)代先進(jìn)的分析技術(shù)來(lái)分析藥材的整體特性，更準(zhǔn)確地鑒別不同中藥及識(shí)別中藥本身的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣。指紋圖譜研究在質(zhì)量評(píng)價(jià)方面應(yīng)用的關(guān)注程度逐漸加強(qiáng)，可借助中藥指紋圖譜鑒別真?zhèn)嗡幉募俺善?，評(píng)價(jià)原料藥材、半成品和成品質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性，目前對(duì)指紋圖譜在中藥材及中成藥上的應(yīng)用研究十分活躍，經(jīng)常采用的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法。
　　
　　本試驗(yàn)采用高校液相色譜法建立五味子藥材指紋圖譜，分別對(duì)不同產(chǎn)地的五味子藥材中木脂素類成分加以分析研究。探討綜合地控制五味子藥材質(zhì)量的方法，力求建立一種分析速度快、方法重現(xiàn)性好的指紋圖譜研究方法，以提高五味子藥材的質(zhì)量控制水平，以更全面地保證藥材質(zhì)量，并為五味子的道地藥材規(guī)范化研究提供基礎(chǔ)研究資料。
　　
　　1　儀器與試藥
　　
　　電子天平(島津AT220)，紫外一可見分光光度計(jì)(島津uv－265Fw)，超聲波清洗器(上海必能信CQ－250)，高效液相色潛儀(美國(guó)安捷倫Agilent1100)。五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào)：886200001，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)。甲醇(色譜純)、重蒸餾水，其他試劑均為分析純。10批五味子藥材分別采集于遼寧省新賓滿族自治縣五味子基地、丹東、桓仁、本溪等地，經(jīng)本院植物教研室王冰教授鑒定，均為正品藥材，藥材來(lái)源見表1。
　　
　　2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
　　
　　2，1　色譜條件　色譜柱：安捷倫C(4.6×150mm)檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；流速：1.0mL／min。流動(dòng)相：采用甲醇(A)、水(B)二元流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相變化情況見表2。
　　2，2　對(duì)照品溶液的制備　取五味子醇甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1mL含0.2mg的溶液，搖勻，即得。
　　2，3　供試品溶液的制備　取不同批次的五味子藥材粉碎，過(guò)三號(hào)篩，取粉末0.5g，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇約20mL，超聲處理(功率250w，頻率33kHz)20min，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
　　
　　2，4　HPLC圖譜繪制　分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，在前述色譜條件下，繪制液相色譜圖。測(cè)定結(jié)果提示，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置處，其有相同保留時(shí)間色譜峰，并標(biāo)定了8個(gè)與相鄰組分分離度良好的共有色譜峰。
　　2，5　方法學(xué)考察
　　2，5，1　精密度試驗(yàn)考察　取同一供試品溶液(樣品號(hào)1)，精密吸取10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，以各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的變化情況，考察試驗(yàn)方法與儀器的精密度?？疾旖Y(jié)果見表3、表4。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明：主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的比值沒(méi)有明顯變化，儀器方法精密度良好。
　　2，5，2　穩(wěn)定性試驗(yàn)考察　取同一份供試品溶液(樣品號(hào)1)，精密吸取10μL，分別在0、2、4、6、8h進(jìn)樣分析，考察各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值，結(jié)果見表5、表6。
　　測(cè)定結(jié)果表明：8h內(nèi)樣品色譜峰面積無(wú)明顯變化，其組分化學(xué)物質(zhì)穩(wěn)定。
　　2，5，3　重復(fù)性試驗(yàn)考察　取五味子藥材(樣品號(hào)1)5份，精密稱定。按上述供試品溶液及測(cè)定方法進(jìn)樣操作，考察各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和色譜峰的比值。測(cè)定結(jié)果見表7、表8。
　　結(jié)果表明：方法重復(fù)性良好。
　　
　　3　指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)
　　
　　3，1　共有峰的標(biāo)定　取不同來(lái)源五味子藥材(表2)，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液備10／zL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，得到不同來(lái)源五味子藥材的HPLC色譜圖。在選定的色譜條件下，以五味子醇甲色譜峰的保留時(shí)間與峰面積值為參照，確定基準(zhǔn)為1，分別計(jì)算不同批次五味子藥材的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的比值，根據(jù)色譜峰在不同樣品中的共有率，結(jié)合成分分析和HPLC色譜圖分析，標(biāo)定了8個(gè)共有色譜峰，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(平均值)依次為1、1.4、1.8、2.0、3.1、3.5、4.3、4.6h。試驗(yàn)結(jié)果見表9。
　　
　　3，2　共有峰面積比值　以供試品色譜中五味子醇甲的色譜峰面積面積作為1，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積。結(jié)果見表10。
　　測(cè)定結(jié)果提示：不同樣品中相對(duì)峰面積差異較大，表明不同來(lái)源五味子藥材之間質(zhì)量差異較大。
　　3，3　相似度考察
　　3，3，1　譜峰匹配　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)樣品相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)合樣品指紋圖譜的譜峰形狀特點(diǎn)對(duì)標(biāo)定的共有峰進(jìn)行匹配，共標(biāo)定8個(gè)共有峰。
　　3，3，2　相似度計(jì)算　采用平均矢量法對(duì)10個(gè)批次五味子藥材指紋圖譜建立共有模式，作為對(duì)照指紋圖譜，將每張指紋圖譜與其進(jìn)行比較，并計(jì)算各個(gè)樣本與基準(zhǔn)樣本的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)，得到各圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。分析結(jié)果見表11。
　　結(jié)果可見，10個(gè)批次五味子藥材指紋圖譜的共有色譜峰相似系數(shù)均在0.999以上，表明10批樣品間具有較高的相似度。同來(lái)源鑒別的結(jié)果基本一致，可以繼續(xù)擴(kuò)大樣品范圍、數(shù)量，以建立北五味子的道地藥材的HPLC指紋圖譜模型。
　　3，3，3　10批五味子藥材指紋圖譜聚類分析　選用平方歐氏距離作為樣本間相似度測(cè)度，對(duì)樣品的相對(duì)保留時(shí)間數(shù)據(jù)、相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用組間連接法為聚類方法對(duì)樣品進(jìn)行歸類。分類結(jié)果見圖1。
　　采用平方歐氏距離作為測(cè)度，進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)的正態(tài)轉(zhuǎn)換，按組間分析法將五味子藥材分為2大類，樣品(7、9號(hào)樣品)和平均樣品(11號(hào))的距離較小。由聚類分析結(jié)果可知，可以根據(jù)不同樣品與平均樣品(基準(zhǔn)樣品)的距離值或利用相似系數(shù)對(duì)五味子藥材樣品進(jìn)行定性鑒別分析。對(duì)于提高五味子藥材質(zhì)量控制水平、保證藥材質(zhì)量提供了有益的參考。
　　
　　4　結(jié)論
　　
　　本實(shí)驗(yàn)建立五味子藥材指紋圖譜，在選定的色譜條件下，以五味子醇甲對(duì)照品色譜峰為參照，根據(jù)在不同樣品中色譜峰的出現(xiàn)頻率，結(jié)合成分分析和HPLC色譜圖分析，選定8個(gè)共有色譜峰，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間依次為1、1.4、1.8、2.0、3.1、3.5、4.3、4.6h?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)樣品的共有峰采用聚類分析方法進(jìn)行研究，初步確定北五味子藥材的標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)。
　　通過(guò)五味子藥材指紋圖譜研究可以看出，雖然同一地區(qū)的藥材有相同保留時(shí)間的共有峰，但峰面積的比值有較大不同，說(shuō)明同是作為北五味子藥材入藥使用，但在成分含量等質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)上仍存在差異。
　　本實(shí)驗(yàn)采用HPLC－紫外檢測(cè)法標(biāo)定8個(gè)共有峰，經(jīng)采用五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲隨行對(duì)照，已確定其中3個(gè)共有峰的歸屬，由于時(shí)間與對(duì)照品的限制，還需深入研究五味子藥材中其它共有峰的歸屬，以更好的控制藥材質(zhì)量。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑進(jìn)行了考察，分別試用乙醇、甲醇溶液作為提取溶劑，結(jié)果表明乙醇作為提取溶劑，所得色譜峰信息量較多。在樣品粉碎粒度和超聲提取時(shí)間上也進(jìn)行了考察。曾試用甲醇－水(55：45)、甲醇－乙腈－水(10：35：55)、乙腈－水(45：55)、乙腈－水(1：1)等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行篩選，結(jié)果表明乙腈－水(1：1)為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰峰形對(duì)稱，分離度良好。本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相洗脫條件進(jìn)行了篩選，先后采用不同比例的甲醇－水洗脫系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，同現(xiàn)行藥典規(guī)定的含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相種類相同。而且在此流動(dòng)相條件下，供試品出峰較多，色譜峰分離度良好，因此確立作為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相系