楊國(guó)燕 陳棟梁 陳 龍 王阿敬

劉 莉 成 靜 陳大偉 汪 麗

（武漢肽類物質(zhì)研究所，湖北 武漢 430023）

膠原三肽的抗氧化功能研究

楊國(guó)燕 陳棟梁 陳 龍 王阿敬

劉 莉 成 靜 陳大偉 汪 麗

（武漢肽類物質(zhì)研究所，湖北 武漢 430023）

研究CTP（膠原三肽）的抗氧化功效并與兩種大分子膠原肽進(jìn)行比較。體外試驗(yàn)采用螯合Fe2＋和清除DPPH自由基能力的方法；體內(nèi)試驗(yàn)采用“D－半乳糖皮下注射制備小鼠衰老模型”，以受試小鼠SOD和GSH－PX活力、MDA含量為檢測(cè)指標(biāo)，考察CTP等膠原肽產(chǎn)品的抗氧化性能。結(jié)果表明，在相同濃度下，CTP螯合Fe2＋和清除DPPH自由基的能力均高于對(duì)照產(chǎn)品；在相同劑量下，膠原三肽能顯著提高衰老小鼠體內(nèi)SOD活力，降低MDA含量，并優(yōu)于對(duì)照產(chǎn)品。與大分子膠原肽相比，膠原三肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

膠原三肽；抗氧化；體外；體內(nèi)

膠原蛋白具有顯著的低免疫原性、生物相容性以及可降解性，在生物體易被吸收，具有親水性強(qiáng)、無毒安全性好等特殊性能［1－2］，因此成為最有用的天然高分子生物材料之一，被廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域。膠原多肽（collagen polypeptide）是膠原蛋白或明膠的水解產(chǎn)物，具有降血壓、降膽固醇、促進(jìn)Ca2＋吸收、抑制光老化等多種生理活性［3－5］。近年來，研究［6］表明小腸對(duì)膠原多肽的吸收率高于對(duì)氨基酸和膠原蛋白的吸收率。

通過最新定向限制性酶切技術(shù)獲得的膠原蛋白水解產(chǎn)物，其中富含低聚微肽（mini－peptide），主要是含三個(gè)氨基酸的膠原三肽（collage tripeptide，簡(jiǎn)稱CTP），其結(jié)構(gòu)可簡(jiǎn)單地表示為“Gly－X－Y”，平均分子量約為280U［7］。由于CTP分子量很小，因此能極有效地滲入角質(zhì)層、真皮層和頭發(fā)根部細(xì)胞內(nèi)［7］。有研究［8］表明，CTP具有抑制動(dòng)脈粥樣化、促進(jìn)骨傷愈合等特殊功能。

目前，對(duì)酶解膠原多肽及其活性的研究較多，但對(duì)膠原三肽抗氧化功能研究的報(bào)道卻很少。本試驗(yàn)重點(diǎn)研究了采用定向限制性酶切技術(shù)制備的膠原三肽的體外螯合Fe2＋和清除DPPH自由基的能力，以及對(duì)D－半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠模型體內(nèi)抗氧化能力等方面的影響，并與大分子膠原肽比較，以期為膠原三肽在食品和美容化妝品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)原料

膠原三肽（CTP）：武漢天天好生物制品有限公司；

普通膠原肽1（CP1）、膠原肽2（CP2）：市購(gòu)。

1.1.2 試劑與藥品

SOD（超氧化物歧化酶）、GSH－PX（谷胱甘肽過氧化物酶）和MDA（丙二醛）測(cè)試盒：南京建成生物技術(shù)公司；

細(xì)胞色素C（MW：12 588U），胰島素（5 733U），桿菌肽（1 423U），甘氨酸－甘氨酸－酪氨酸－精氨酸（451U），甘氨酸－甘氨酸－甘氨酸（189U）和Ferrozine（菲洛嗪）、DPPH（2，2－二苯基－1－間三硝基苯基聯(lián)肼）：美國(guó)Sigma公司；

氯化亞鐵：分析純，臺(tái)山市聯(lián)興化工有限公司；

無水乙醇：分析純，上海振興化工一廠；

D－半乳糖：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

小白鼠（雄性）：昆明清潔級(jí)，華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋：DK－98－II型，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：T6新世紀(jì)型，北京普析通用有限責(zé)任公司；

電子天平：AR2140型，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；

高速臺(tái)式離心機(jī)：TGL－16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

高效液相色譜：Agilent 1100型，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 理化指標(biāo)測(cè)定

（1）水分：參照GB/T 5009.3——2010進(jìn)行測(cè)定；

（2）灰分：參照GB/T 5009.4——2010進(jìn)行測(cè)定；

（3）蛋白含量：參照 GB/T 5009.5——2010進(jìn)行測(cè)定；

（4）多肽含量：參照 GB/T 22729——2008進(jìn)行測(cè)定；

（5）分子量分布：采用HPLC法測(cè)定。

色譜柱：TSKgel G2000SWXL300mm×7.8mm，柱溫：室溫，流動(dòng)相∶乙腈＋水＋三氟乙酸＝45＋55＋0.1，波長(zhǎng)220nm，體積流量0.8mL/min。

分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別用流動(dòng)相配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1mg/mL的細(xì)胞色素C、胰島素、桿菌肽、甘氨酸－甘氨酸－酪氨酸－精氨酸、甘氨酸－甘氨酸－甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按一定比例混合后進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作線性回歸得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線及其方程。

樣品處理：將樣品稀釋5倍，過濾，取濾液20μL上樣。

分子量分布的計(jì)算：用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線中進(jìn)行計(jì)算，即可得到樣品的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布范圍。

1.2.2 螯合 Fe2＋能力的測(cè)定 參考 Chung的方法［9］，取1.5% 的膠原產(chǎn)品水溶液5mL，分別加入2mM FeCl2溶液0.1mL及5mM Ferrozine溶液0.2mL，反應(yīng)10min，于562nm測(cè)其吸光值。空白用0.2mL水代替Ferrozine溶液，對(duì)照試樣為蒸餾水。螯合率按式（1）計(jì)算：

1.2.3 清除自由基DPPH能力的測(cè)定方法 參考Bernard等的方法［10－11］，分別取一定濃度的膠原產(chǎn)品水溶液2.5mL，加入2.5mL無水乙醇，分別加入新鮮配制的0.4mM DPPH乙醇溶液1mL，呈深紫藍(lán)色，混合均勻，避光反應(yīng)15min。用分光光度計(jì)在517nm波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光值。以無水乙醇溶液為空白，以5mL無水乙醇加1mL DPPH乙醇溶液為對(duì)照。DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算：

以樣品濃度對(duì)DPPH自由基清除率作圖，可以得到清除50%DPPH自由基時(shí)所需樣品的濃度，即IC50。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn) 小白鼠70只，體重25～30g。試驗(yàn)分為5組，分別為空白組，模型組，CTP組，CP1組，CP2組。

灌胃劑量：將動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3d，空腹12h后稱體重，按體重隨機(jī)分組，試驗(yàn)共進(jìn)行55d。受試組按1.33g/（kg·bw）給動(dòng)物灌胃樣品，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予相應(yīng)量的蒸餾水。試驗(yàn)期間每周測(cè)體重1次，并根據(jù)體重狀況調(diào)整灌胃劑量。

衰老模型小鼠的制備：試驗(yàn)采用D－半乳糖衰老模型，造模與灌胃同時(shí)進(jìn)行。除空白對(duì)照組外，其余組均用D－半乳糖頸背部皮下注射（1.0g/（kg·Bw））。每周稱1次體重，根據(jù)體重調(diào)整劑量，連續(xù)注射55d。

灌胃第55天，首先眼球取血（離心收集血清用于SOD和GSH－PX指標(biāo)檢測(cè)），然后分取肝組織0.10～0.20g加生理鹽水用玻璃勻漿器研磨成5%勻漿液，離心取上清液測(cè)定MDA含量。超氧化物歧化酶活力測(cè)定、谷胱甘肽過氧化物酶活力測(cè)定、丙二醛含量測(cè)定均按照試劑盒內(nèi)說明書的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果用±s表示，用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原肽的理化指標(biāo)

由表1、表2可知，3種膠原產(chǎn)品的灰分、蛋白質(zhì)及多肽含量的檢測(cè)結(jié)果較為接近，但分子量分布有較大區(qū)別。CP1大于1 000U的占41.2%，CP2大于1 000U 的占35.7%，而CTP大于1 000U的僅占9.5%，分子量大部分集中在200～500U之間，含量占50%以上。

表1 不同膠原產(chǎn)品的理化指標(biāo)Table 1 The guide line of physics and chemistry of different collagen /%

表2 不同膠原產(chǎn)品的分子量分布Table 2 The molecular weight distribution of different collagen

2.2 體外抗氧化試驗(yàn)

將各受試物配制成1.5%溶液測(cè)定亞鐵離子螯合率，如表3所示，分子量分布主要在200～500U的CTP的螯合率最高，分子量分布主要在500U以上的CP的螯合率較低。

表3 體外抗氧化功能測(cè)定結(jié)果的比較ńTable 3 Comparison of the result of anti－oxidation in vitro（n＝7，x±s）

表3 體外抗氧化功能測(cè)定結(jié)果的比較ńTable 3 Comparison of the result of anti－oxidation in vitro（n＝7，x±s）

ń ＊＊與CTP組有顯著差異（P＜0.01）。

名稱 螯合率/% DPPH IC50/（mg·mL－1）CTP 60.05±1.34 11.0±0.1 CP1 21.68±0.53＊＊ 22.2±0.1＊＊CP2 28.52±0.62＊＊ 25.6±0.1＊＊

將各受試物配制成不同濃度溶液，測(cè)定DPPH自由基清除率，并計(jì)算IC50。IC50值越小，表明該物質(zhì)清除自由基能力越強(qiáng)。如表3所示，分子量分布主要在200～500U的CTP的DPPH清除自由基能力最高，分子量分布主要在500U以上的清除DPPH自由基能力較低。

2.3 體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)

2.3.1 丙二醛（MDA）的測(cè)定 小鼠肝組織丙二醛的測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 MDA測(cè)定結(jié)果的比較ńTable 4 Comparison of the result of MDA （n＝14，x±s）

表4 MDA測(cè)定結(jié)果的比較ńTable 4 Comparison of the result of MDA （n＝14，x±s）

ń ＊與空白組有顯著差異（P＜0.05），▲與模型組有顯著差異（P＜0.05），＃ 與CTP組有顯著差異（P＜0.05）。

組別 動(dòng)物數(shù) MDA/（nmol·mg－1PROT）14 1.56±0.43模型 14 2.44±0.88＊CTP 14 1.34±0.81▲CP1 14 1.99±0.58 CP2 14 2.20±0.95空白＃

由表4可知，與空白對(duì)照組相比較，模型對(duì)照組丙二醛的平均含量顯著高于對(duì)照組，表明小鼠經(jīng)半乳糖造模已引起肝臟脂質(zhì)過氧化。與模型對(duì)照組相比較，CTP組的丙二醛平均含量顯著低于模型對(duì)照組。而且CTP組的丙二醛平均含量顯著低于CP2組。

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定 小鼠血清SOD活力的測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 SOD測(cè)定結(jié)果ńTable 5 Comparison of the result of SOD（n＝14，x±s）

表5 SOD測(cè)定結(jié)果ńTable 5 Comparison of the result of SOD（n＝14，x±s）

ń ＊與空白組有顯著差異（P＜0.05），▲與模型組有顯著差異（P＜0.05），▲▲與模型組有極顯著差異（P＜0.01），＃與CTP組有顯著差異（P＜0.05）。

組別 動(dòng)物數(shù) SOD/（U·mL－1）14 157.9±26.0模型 14 114.9±33.1＊CTP 14 152.1±15.5▲▲CP1 14 131.7±19.4＃CP2 14 146.1±19.0空白▲

由表5可知，與空白對(duì)照組相比較，模型對(duì)照組的SOD活力降低，且差異顯著，說明造模成功。與模型對(duì)照組相比較，CP2組的SOD活力顯著高于模型對(duì)照組，CTP組的SOD活力極顯著高于模型對(duì)照組。表明CTP恢復(fù)機(jī)體SOD活力強(qiáng)于CP2。而且CTP組的SOD活力顯著高于CP1組。

2.3.3 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）的測(cè)定 小鼠血清GSH－PX活力的測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 GSH－PX測(cè)定結(jié)果ńTable 6 Comparison of the result of GSH－PX（n＝14，x±s）

表6 GSH－PX測(cè)定結(jié)果ńTable 6 Comparison of the result of GSH－PX（n＝14，x±s）

ń ＊與空白有顯著差異（P＜0.05），▲與模型有顯著差異（P＜0.05）。

組別 動(dòng)物數(shù) GSH－PX（活力單位）14 605.1±158.3模型 14 522.9±152.2 CTP 14 528.5±101.0 CP1 14 529.2±128.7空白CP2 14 523.5±111.6

由表6可知，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和各受試組的血清GSH－PX均無顯著差異。

3 討論

近年來，很多學(xué)者開始專注于研究膠原肽對(duì)機(jī)體氧化和過氧化平衡的影響。劉小玲等［12］自制90%以上相對(duì)分子質(zhì)量低于10kU的膠原肽，發(fā)現(xiàn)其對(duì)由Fe2＋引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體過氧化有一定抑制作用，同時(shí)對(duì)·OH具備一定的清除作用。還有學(xué)者［13－14］研究發(fā)現(xiàn)，以四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病鼠經(jīng)灌胃海洋膠原肽（3.25g/（kg·Bw））能顯著增加肝臟SOD活力，降低肝臟MDA含量，保護(hù)肝腎功能；以D－半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠經(jīng)灌胃海洋膠原肽（0.45，1.35g/（kg·Bw））能顯著增加血清SOD活力，降低血清MDA含量。以上試驗(yàn)都證明膠原肽具有一定的抗氧化作用。

通過兩種體外抗氧化能力測(cè)定結(jié)果可見，相對(duì)分子質(zhì)量集中在200～500U的膠原三肽的螯合亞鐵離子能力和清除DPPH自由基能力均優(yōu)于大于1 000U的占35%以上的大分子膠原肽，在一定程度上抑制由金屬離子產(chǎn)生的自由基對(duì)人體造成的傷害，能更有效的阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

體內(nèi)試驗(yàn)采用半乳糖衰老模型，半乳糖供給過量，超常產(chǎn)生活性氧，打破了受控于遺傳模式的活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)，引起過氧化效應(yīng)。半乳糖屬于皮下吸收，其過氧化產(chǎn)物及機(jī)體產(chǎn)生的抗過氧化酶類也主要集中于體液中。本試驗(yàn)造模效果為：模型組的SOD活力和MDA含量與對(duì)照組相比差異顯著，并呈陽性，表明造模成功。D－半乳糖攻擊機(jī)體產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)SOD活力下降，自由基過氧化物MDA含量增加。在相同劑量（1.33g/（kg·Bw））下，CTP組的SOD活力和MDA含量較對(duì)照組呈陽性結(jié)果，尤其是CTP組的SOD活力有極顯著增加，表明CTP有很高的抗氧化活性，能提高SOD活力，降低MDA含量。大分子的CP2僅SOD含量較對(duì)照組呈陽性結(jié)果。根據(jù)中華人民共和國(guó)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)與檢驗(yàn)方法規(guī)范》中抗氧化試驗(yàn)的結(jié)果判定準(zhǔn)則：抗氧化酶活性任一指標(biāo)和過氧化脂質(zhì)含量指標(biāo)均為陽性，可判定該受試樣品具有抗氧化作用。提示CTP具有抗衰老（抗氧化）功能，而大分子的CP1、CP2無抗衰老（抗氧化）功能。3種受試物中CTP的相對(duì)分子質(zhì)量集中在200～500U，分子量最小，其抗氧化功效最強(qiáng)，初步說明抗氧化效果隨相對(duì)分子質(zhì)量減少，空間位阻減小而增強(qiáng)，然而CTP被人體吸收后如何代謝等問題尚不清楚，還需進(jìn)一步研究探討。

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Study on the antioxidant function of collagen tripeptide

YANG Guo－yan CHENDong－liang CHEN Long WANG A－jing

LIU Li CHENG Jing CHENDa－weiWANG Li

（Wuhan Peptide Substance Research Institution，Wuhan，Hubei430023，China）

The antioxidant function of collagen tripeptide was investigated and compared with two kinds of high molecular weight collagen peptide.The vitro antioxidant function of CTP and other similar products was assayed by chelating ferrous ion and clearing the DPPH·method.The antioxidant function in vivo of CTP and other collagen peptides was assayed by D－galactose aging model mice prepared by subcutaneous injection as the experiment animals.The detection index included superoxide dismutase activity，glutathione peroxidase activity（antioxidant enzyme activity）and malondialdehyde content（lipid peroxide content）.The collagen tripeptide produced has much higher chelating ferrous ion and clearing the DPPH·antioxidant activity than other collagen peptides at the same concentration.The collagen trieptide can enhance the SOD activity and reduce the MDA content，which has a high vivo antioxidant activity than other collagen peptides at the same dosage.Compared with two kinds of high molecular weight collagen peptide，CTP has better antioxidant function.

collagen tripeptide；antioxidant；in vitro；in vivo

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

楊國(guó)燕（1979－），女，中國(guó)多肽產(chǎn)業(yè)集團(tuán)助理研究員，碩士。E－mail：tallyho－peptide＠163.com

2010－07－12