王 雙王昌濤都曉偉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.北京工商大學植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048）

訶子中活性物質的提取及其抗氧化、抑菌作用研究

王 雙1王昌濤2都曉偉1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.北京工商大學植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048）

利用微波法提取訶子中抗氧化活性物質。以抗氧化活性為指標，采用響應面法研究溫度、時間、料液比對產(chǎn)物抗氧化活性的影響。在溫度53.6℃，時間3min，料液比1∶19（m∶V）的條件下，產(chǎn)物抗氧化活性即Trolox濃度為63 081μmol/L。產(chǎn)物對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子具有清除作用，其IC50值分別為0.44，1.01，0.64mg/mL，產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌有抑制作用，而對黑曲霉無抑制作用。

微波；訶子；抗氧化；功效

訶子 （terminalia chebula retz.）為使君子科欖仁樹屬植物訶子及其變種絨毛訶子的干燥成熟果實，是藏族習用藥材，被譽為“藏藥之王”［1］。訶子原產(chǎn)于印度、緬甸等地，在中國云南、廣東、廣西等地也有分布。訶子的主要成分為鞣質和多元酚，它們可以終止自由基的連鎖反應，具有抗氧化活性［2－8］。微波提取法是一種新型的提取技術，它具有選擇性高、提取時間短、加熱效率高、質量好、安全無污染的特點［9］。迄今未見到微波法提取訶子成分的相關報道，本試驗采用微波提取技術從訶子中獲得抗氧化活性物質，并對提取物進行抗氧化活性及抑菌作用的功效研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

訶子：北京同仁堂藥店；

無水乙醇、30%過氧化氫：分析純，北京化工廠；

甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

DPPH、Trolox：純度≥98%，德國Sigma公司；

氯化硝基四氮唑藍（NBT）、番紅花紅、核黃素、EDTA－2Na、蛋氨酸：純度≥98%，國藥集團化學試劑有限公司；

硫酸亞鐵：分析純，天津市天大化工實驗廠。

1.1.2 主要儀器

離心機：3－18K，德國Sigma公司；

紫外可見分光光度計：T6，北京普析通用儀器有限責任公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－1，國華電器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG－9030A，上海精宏實驗設備有限公司；

電子天平：DENVER，北京賽多利斯儀器系列有限公司；

微波儀：MARS5，培安CEM微波化學（中國）技術中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 Trolox標準曲線的繪制 稱取12.5mg DPPH溶解于甲醇中，再定容至100mL，使用時稀釋5倍至25mg/L。稱取Trolox標準品適量，用乙醇分別配制為0，200，400，600，800，1 000μM 的標準品溶液，然后吸取0.1mL不同濃度的標準品溶液，分別加入3.9mL DPPH甲醇溶液，在黑暗處反應20min后于515nm處測定吸光度A，用甲醇調零［10］。根據(jù)試驗結果，繪制以吸光度A為Y軸和Trolox濃度（μmol/L）為X軸的標準曲線，結果見圖1。測定樣品溶液的Trolox濃度時，所得結果乘以溶液稀釋倍數(shù)。

圖1 Trolox標準曲線Figure 1 Trolox standard curve

1.2.2 微波法提取抗氧化活性物質的工藝及單因素試驗

稱取訶子粉末（過50目篩）適量，按照一定的料液比與提取溶劑混合，在一定溫度下微波提取一定時間，提取液離心，取上清液稀釋適當倍數(shù)，測得Trolox濃度。分別考察乙醇濃度、料液比、溫度和時間4個單因素對抗氧化活性物質提取的影響，確定單因素的最佳條件，再根據(jù)單因素試驗結果進行響應面試驗，確定抗氧化活性物質的最佳提取工藝。

（1）乙醇濃度單因素試驗：該試驗變量為乙醇濃度，其分別設為30%、40%、50%、60%、70%，固定參數(shù)包括料液比1∶30（m∶V）、微波功率1 200W、溫度60℃和時間3min，測定提取液的抗氧化能力。

（2）料液比單因素試驗：該試驗變量為料液比，其分別設為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（m∶V），固定參數(shù)包括乙醇濃度50%、微波功率1 200W、溫度60℃和時間3min，測定提取液的抗氧化能力。

（3）溫度單因素試驗：該試驗變量為溫度，其分別設為40，50，60，70，80 ℃，固定參數(shù)包括乙醇濃度50%、料液比1∶20（m∶V）、微波功率1 200W和時間3min，測定提取液的抗氧化能力。

（4）時間單因素試驗：該試驗變量為時間，其分別設為1，3，5，7，9min，固定參數(shù)包括乙醇濃度50%、料液比1∶20（m∶V）、微波功率1 200W和溫度60℃，測定提取液的抗氧化能力。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定 采用DPPH 95%乙醇體系測定法［11］。

1.2.4 羥自由基清除率的測定 采用二價鐵離子測定法［12］。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除率的測定 采用光照核黃素測定法［12］。

1.2.6 抑菌試驗 選擇金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌、黑曲霉作為考察菌，分別使用最適培養(yǎng)基，采用濾紙片法，測量抑菌圈直徑的大小作為抑菌物質生物效果評定的依據(jù)，抑菌圈直徑≤6mm視為無抑菌作用［13］。

2 結果與分析

2.1 微波法提取抗氧化活性物質的單因素試驗

單因素試驗結果表明，隨著乙醇濃度的增大，Trolox濃度呈先增后減的趨勢，當乙醇濃度為50%時，Trolox濃度最大，即抗氧化活性物質提取效果最好；隨著料液比的增大，Trolox濃度逐漸增大，當料液比為1∶20（m∶V）時曲線上升趨勢趨于平緩，故料液比采用1∶20（m∶V）；隨著溫度的增高，Trolox濃度呈先增后減的趨勢，當溫度為60℃時Trolox濃度最大，即抗氧化活性物質的提取效果最好；隨著時間的增加，Trolox濃度呈先增后減的趨勢，當時間為3min時，Trolox濃度最大，即抗氧化活性物質的提取效果最好。

2.2 微波法提取抗氧化活性物質的響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計 根據(jù)單因素試驗的結果，選擇溫度、時間、料液比3個單因素，設計3因素3水平的響應面試驗，試驗設計及結果見表1、2。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and level of response surface experiment

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface results

2.2.2 響應面方差分析 利用SAS軟件對響應面試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表3 影響因素的方差分析Table 3 The factors affecting the variance analysis

由表3的方差分析結果可知：時間（X2）和料液比（X3）在試驗過程中起主要作用，而溫度（X1）相對來說作用小一些，即對微波提取法的影響效果：時間＞料液比＞溫度。

2.2.3 響應面統(tǒng)計檢驗 利用SAS軟件對響應面結果進行統(tǒng)計檢驗，結果見表4。

表4 模型的可信度分析的統(tǒng)計檢驗結果Table 4 The statistical analysis of the credibility of the model test results

由表4中復相關系數(shù)R2＝97.07%，說明方程的因變量與全體自變量之間的回歸效果顯著，可用于試驗分析。

2.2.4 回歸方程 利用SAS程序對響應值進行回歸分析，經(jīng)回歸擬和后得到回歸方程：

2.2.5 回歸方程方差分析 利用SAS程序對回歸方程進行方差分析，結果見表5。

表5 回歸方程各項的方差分析ńTable 5 The regression equation of variance analysis

由表5可知，方差的一次項顯著，二次項極其顯著，說明各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的一次線性關系；交互項顯著，因此各因素之間存在交互作用，在試驗中的影響不可忽略。另外總回歸項極其顯著證明回歸方程擬合程度較好，具有很高的可信性和準確性；失擬項不顯著，說明試驗的誤差很小。

2.2.6 響應面曲面及等高線圖 利用SAS軟件得到響應面曲面及等高線圖，見圖2～4。

圖2 溫度和時間對Trolox濃度的響應曲面及等高線圖Figure 2 Trolox concentration response surface on temperature and time

圖3 溫度和料液比對Trolox濃度的響應曲面及等高線圖Figure 3 Trolox concentration response surface on temperature and solid to liquid ratio

通過響應面試驗結果進行分析，由模型求偏導計算得出最佳提取工藝的反應條件為：溫度為53.6℃，時間為3min，料液比為1∶19（m∶V）。為了驗證響應條件的正確性，按照最佳提取條件組合進行平行試驗，結果表明，該工藝下提取液的抗氧化能力即Trolox濃度為62 870μmol/L，與理論值（63 081μmol/L）接近，故響應條件具有較高的可靠性和重復性。

圖4 時間和料液比對Trolox濃度的響應曲面及等高線圖Figure 4 Trolox concentration response surface on time and solid to liquid ratio

2.3 提取物抗氧化活性的測定

2.3.1 提取物對DPPH自由基清除率的測定 根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL溶液，根據(jù)1.2.3方法測定DPPH自由基清除率，結果見圖5。

圖5 DPPH自由基清除率的測定Figure 5 DPPH radicals clearance

由圖5可知，隨著訶子提取物濃度的增大，DPPH自由基清除率逐漸增大，當訶子提取物的濃度為1.0mg/mL時，DPPH自由基清除率達到90%以上，其IC50值為0.44mg/mL。

2.3.2 提取物對羥自由基清除率的測定 根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mg/mL溶液，根據(jù)1.2.4方法測定羥自由基清除率，結果見圖6。

圖6 羥自由基清除率的測定Figure 6 Hydroxyl radicals clearance

由圖6可知，隨著訶子提取物濃度的增大，羥自由基清除率逐漸增大，當訶子提取物的濃度為1.8mg/mL時，羥自由基清除率達到80%以上，其IC50值為1.01mg/mL。

2.3.3 提取物對超氧陰離子清除率的測定 根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL溶液，根據(jù)1.2.5方法測定超氧陰離子清除率，結果見圖7。

由圖7可知，隨著訶子提取物濃度的增大，超氧陰離子清除率逐漸增大，當訶子提取物的濃度為1.0mg/mL時，超氧陰離子清除率達到80%以上，其IC50值為0.64mg/mL。

圖7 超氧陰離子清除率的測定Figure 7 Super oxide anion clearance

2.4 提取物抑菌作用的測定

根據(jù)微波提取法的最佳提取工藝制備訶子的提取物，稱取提取物的干燥粉末適量，用水配制成0.5，0.05，0.005g/mL溶液，進行抑菌試驗，根據(jù)1.2.6方法測量抑菌圈直徑大小，結果見表6。

由表6可知，當訶子提取物的濃度為0.5g/mL時，對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌均具有較好的抑制作用，而對黑曲霉無抑制作用；當訶子提取物的濃度為0.05g/mL時，對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有抑制作用，而對大腸桿菌和黑曲霉無抑制作用；當訶子提取物的濃度為0.005g/mL時，對4種菌均無抑菌作用。訶子提取物對這4種菌的抑制作用大小順序為：金黃色葡萄球菌、白色念珠菌＞大腸桿菌＞黑曲霉，其中金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最小抑菌濃度為0.005g/mL，大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.05g/mL。

表6 不同濃度提取液的抑菌作用測定Table 6 Different concentrations extract bacteriostatic action

3 討論

（1）微波法提取訶子中抗氧化活性物質的最佳提取工藝為：溫度為53.6℃，時間為3min，料液比為1∶19（m∶V），通過研究訶子的微波提取物對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除作用，可知訶子的微波提取物具有較好的抗氧化活性，對自由基的清除作用大小依次為清除DPPH自由基作用＞清除超氧陰離子作用＞清除羥自由基作用。

（2）訶子的微波提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均有抑制作用，而對黑曲霉無抑制作用，抑制作用大小依次為抑制金黃色葡萄球菌、白色念珠菌＞抑制大腸桿菌＞抑制黑曲霉。

（3）自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害物質，能夠損害機體的細胞和組織，甚至引起衰老效應或者慢性疾病，本試驗對訶子的抗氧化活性進行了初步研究，為其在醫(yī)藥和保健等方面的深入研究和應用提供參考和依據(jù)，而對于訶子抗氧化活性成分的分離純化方面還有待于進一步深入的研究。

1 國家藥典委員會.ISBN 7－5025－6525－6/R·262中華人民共和國藥典［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2005.

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Research of antioxidant activity in fructus chebulae

WANG Shuang1WANG Chang－tao2DU Xiao－wei1

（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang150040，China；2.Beijing Technology and Business University，Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing100048，China）

This experiment extracted antioxidant substances from Terminalia Chebulae Retz in Microwave method.Regard the antioxidant activity as an index，the effect of temperature，time，and the liquid ratio on the antioxidant activity was studied by the response surface analysis.Under the conditions of 53.6 ℃ extracting temperature，3 min extracting time，and liquid ratio 1∶19（m∶V），the concentration of Trolox is 63 081μmol/L.Products has scavenging action to DPPH radical，hydroxyl radical，superoxide anion，IC50were 0.44，1.01，0.64mg/mL respectively.And Staphylococcus aureus，Candida albicans，E.coliwere inhibited，while no inhibitory effect on Aspergillus Niger.

microwave；fructus chebulae；antioxidant activity；effect

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

北京市科技新星項目（編號：2008B08）

王雙（1985－），女，黑龍江中醫(yī)藥大學在讀碩士研究生。E－mail：wangs1985＠126.com

都曉偉

2010－07－12