王 宇,陳 彤,張?jiān)旅?劉春陽(yáng),張 琳,顧 佳

(大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人參中的多菌靈殘留

王 宇,陳 彤,張?jiān)旅?劉春陽(yáng),張 琳,顧 佳

(大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

在酸性條件下以甲醇提取人參樣品中的多菌靈殘留,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。以體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸-甲醇水溶液梯度洗脫,樣品的提取方法為固液萃取,流動(dòng)相為甲醇,體積流量0.2mL/min,運(yùn)行時(shí)間10 min。質(zhì)譜采用正離子掃描模式,定性碎片離子是192.10/160.05、192.10/132.06、192.10/105.06,定量碎片離子為 192.10/160.05。儀器檢出限和方法檢出限分別是 0.5 pg和0.022 ng/g,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～2.29%,回收率為88.23%～95.07%。研究表明該方法的精準(zhǔn)度以及靈敏度均達(dá)到要求,適用于人參中多菌靈殘留的檢測(cè)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;多菌靈;人參

0 引 言

多菌靈學(xué)名N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯,是一種高效、低毒、廣譜抗植物真菌藥,可預(yù)防多種植物病害[1-2]。由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,殘留在果品蔬菜中,導(dǎo)致多菌靈殘留累積,并通過(guò)食物鏈影響人體健康,可引起肝病及導(dǎo)致染色體畸變等病癥[3]。隨著國(guó)際市場(chǎng)對(duì)人參農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格,農(nóng)殘問(wèn)題已成為我國(guó)人參出口的主要障礙。國(guó)內(nèi)外對(duì)多菌靈殘留量檢測(cè)已有報(bào)道,其分析方法有氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、分光光度法[6]、紫外光譜分析法[7]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[8-9]。目前的檢測(cè)方法普遍存在靈敏度較低檢出限較高的問(wèn)題,已不能滿(mǎn)足快速準(zhǔn)確定性定量的要求,所以建立低檢出限、高準(zhǔn)確率的液質(zhì)聯(lián)用方法十分重要。由于樣品中基質(zhì)復(fù)雜干擾較多,HPLC-MS/MS能有效地消除基質(zhì)的干擾,定性定量準(zhǔn)確,檢出限相對(duì)較低,因此本文建立了HPLC-MS/MS檢測(cè)人參中多菌靈的方法,并對(duì)大連市售5種人參樣品中的多菌靈進(jìn)行了檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試 劑

多菌靈,純度均大于99%,美國(guó) sigma公司;甲醇(HPLC級(jí)),乙腈(HPLC級(jí))均購(gòu)自美國(guó)Tedia;實(shí)驗(yàn)用水(Millipore系統(tǒng)產(chǎn)生的超純水)。

混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液(100μg/mL):準(zhǔn)確稱(chēng)量多菌靈5 mg,用甲醇定容到100mL棕色容量瓶中,超聲混勻,4℃下避光儲(chǔ)存,即為貯備液。標(biāo)準(zhǔn)使用液(1～200μg/L)。

1.2 儀 器

帶自動(dòng)進(jìn)樣器的 Finnigan Surveyor液相色譜系統(tǒng)(Thermo Electron,USA),Finnigan TSQ Quantum Discovery MAX三重四極桿質(zhì)譜分析儀,Waters Symmetry-C18(150mm×2.1mm i.d.,3.5μm,USA),恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-300C),水平振蕩搖床(HY-2)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000),低速大容量多管離心機(jī)RJ-LD-ⅡB。

1.3 樣品萃取

本實(shí)驗(yàn)所用萃取方法為固液萃取。準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的人參樣品5.0g于100mL離心管中,加入20mL甲醇和5.0mL 0.1 mol/L HCl,漩渦混勻,在25℃恒溫?fù)u床振蕩3 h,4 000 r/min離心5 min,將萃取液轉(zhuǎn)移至100mL雞心瓶中,重復(fù)萃取1次,合并提取液于30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5.0mL。將濃縮液轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗中,加入5.0mL 0.1 mol/L HCl和 25mL 10%NaCl溶液,混合均勻,再加入20mL石油醚于水平振蕩搖床上振蕩萃取10 min。靜置分層后棄去石油醚,水相用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,用20mL二氯甲烷萃取3次,萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉除水后轉(zhuǎn)移至100mL雞心瓶中,40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入1mL甲醇定容,過(guò)0.22μm有機(jī)系及水系的微孔濾膜后,于HPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜

流動(dòng)相為甲醇(A)和0.1%甲酸(B),色譜分離為梯度洗脫:0～1 min,40%A;1～3 min,40%～60%A;3～4 min,80%～20%A;5～6 m in,40%～60%A;體積流量為0.2mL/m in;進(jìn)樣量為10μL。

1.4.2 質(zhì) 譜

采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式進(jìn)行檢測(cè),監(jiān)測(cè)模式為選擇反應(yīng)性監(jiān)測(cè)模式(SRM)。具體參數(shù):噴射電壓為3 000 V,鞘氣體積流量為2.1L/min,輔助氣體積流量為1.5L/min,離子傳輸管溫度為300℃,源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓(CID)為-12 V,參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 SRM監(jiān)測(cè)模式參數(shù)Tab.1 Parameters in SRMmode

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化:將標(biāo)準(zhǔn)溶液利用流動(dòng)注射泵分別注入離子源,對(duì)其進(jìn)行全掃描,確定母離子并通過(guò)優(yōu)化離子傳輸管電壓、噴射電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力使母離子豐度及穩(wěn)定性最佳;然后對(duì)化合物進(jìn)行子離子掃描得到碎片信息,并對(duì)二級(jí)質(zhì)譜碰撞氣能量(CE)進(jìn)行優(yōu)化,使特征碎片離子的強(qiáng)度達(dá)到最大。

HPLC-MS/MS不像單純色譜分離那樣需要達(dá)到一定的分離度才能進(jìn)行準(zhǔn)確地定性及定量分析。在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用中,目標(biāo)化合物在液相色譜柱中的分離只是粗分離,進(jìn)入質(zhì)譜后,由一級(jí)質(zhì)譜選擇母離子,將其打碎,再由二級(jí)質(zhì)譜選擇碎片離子進(jìn)行定性定量,因此二級(jí)質(zhì)譜比一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)更為準(zhǔn)確。這樣既能有效防止樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,又能排除分子量相同而特征碎片離子不同的物質(zhì),從而降低檢出限并節(jié)省大量時(shí)間。圖1為在本實(shí)驗(yàn)條件下100μg/L多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際樣品的總離子流圖和特征離子譜圖。

2.2 分析條件選擇

多菌靈是一種兩性化合物,在中性和偏堿性水溶液中溶解度低,微溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿等有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)以甲醇、乙腈和水作為研究對(duì)象,比較其對(duì)多菌靈的提取效果。取空白樣品,加入多菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 ng/g),然后分別用甲醇、乙腈和水提取,同前述方法凈化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲醇-鹽酸法和乙腈-鹽酸法回收率較高,分別為93.2%和94.5%;而水提法回收率僅為30.3%。由于考慮成本,故選擇醇提法。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn),選擇了甲酸作為調(diào)節(jié)劑改善了以甲醇-水為流動(dòng)相洗脫時(shí)多菌靈峰型寬且拖尾的問(wèn)題,使峰型得到改善。

圖1 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液和西洋參樣品提取液的總離子色譜(a,b)和二級(jí)質(zhì)譜(c,d)圖Fig.1 Current chromatograms of total ions(a,b)and MS/MS spectra(c,d)of carbendazim standard solution and sampLe extraction solution

2.3 回收率和精密度

方法回收率是通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)來(lái)計(jì)算的。在已知多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.08 ng/g)的藥材中準(zhǔn)確加入一定量的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品,按同樣的操作步驟進(jìn)行提取、凈化、測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果列于表2。多菌靈的平均加樣回收率為88.23%～95.07%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%～2.29%。

表2 加標(biāo)回收率及其精密度Tab.2 Recovery and p recision of carbendazim

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定

將貯備液用甲醇稀釋成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液(200、100、50、10、5、0.5μg/L),將這6種使用液按上述液質(zhì)條件上機(jī)測(cè)定,每個(gè)分別測(cè)3次,取其峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)作線(xiàn)性回歸,線(xiàn)性范圍為0.5～200μg/L,線(xiàn)性方程為y=-44 482.3+408 413x,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

2.5 檢出限

以S/N=3來(lái)估算儀器的檢出限(LOD),多菌靈的儀器檢出限為0.5 pg,以回收率計(jì)算方法檢出限為0.022 ng/g。

3 實(shí)際樣品的測(cè)定

樣品為市售5種人參產(chǎn)品。經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè),所測(cè)人參中多菌靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.548、0.069、0.330、0.898、1.872 ng/g,所測(cè)樣品均未超標(biāo)。我國(guó)食品農(nóng)藥殘留國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和歐盟食品中農(nóng)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)分別是0.5和0.1 mg/kg,而本方法靈敏度高,檢出限比標(biāo)準(zhǔn)低5個(gè)數(shù)量級(jí),優(yōu)于當(dāng)前其他檢測(cè)方法,可應(yīng)用于經(jīng)高效液相色譜測(cè)定的陰性樣品的確證,適用于人參中多菌靈殘留的檢測(cè)與安全監(jiān)控。

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Determ ination of carbendazim inginseng byLiquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Yu,CHEN Tong,ZHANG Yue-mei,LIU Chun-yang,ZHANGLin,GU Jia
(School of Biological&Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

Samples were extracted byLiquid-solid extraction method,then determined by HPLC-Ms/Ms.The separation of carbendazim was performed,usinggradient elution of methanol-water(containing 0.1%methane acid).The mobile phase was acetonitrile,while the flow rate and running time were 0.2mL/min and 10 min.Positive ions were used fo r the scan mode of mass spectrometry,fragment ions used for quantitative analysis were 192.10/160.05,192.10/132.06 and 192.10/105.06,for qualitative was 192.10/160.05.DetectionLimits of the compound and method detectionLimit were 0.5 pg and 0.022 ng/g respectively.The recoveries of carbendazim were 88.23%to 95.07%,and the relative standard deviation of this method was between 1.3%to 2.2%.

HPLC-MS/MS;carbendazim;ginseng

TS207.7;O657

A

1674-1404(2010)03-0165-03

2009-08-03.

王 宇(1984-),男,碩士研究生.