霍瑾茹

（北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京 100083）

牡丹（Paeonia suffruticosa），又名富貴花、百兩金、木芍藥、鼠姑、鹿韭，為芍藥科芍藥屬多年生灌木植物，是一種原產(chǎn)于中國西部秦嶺和大巴山一帶山區(qū)的傳統(tǒng)名花，享有“花王”的美譽。我國既是牡丹野生種的原產(chǎn)中心和分布中心，又是牡丹園藝品種的栽培中心，擁有四大品種群系。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，基因工程技術(shù)在牡丹上也得到了較為廣泛的應(yīng)用。

1 分子標記技術(shù)在牡丹親緣鑒定上的應(yīng)用

我國具有極為豐富的牡丹資源，據(jù)初步統(tǒng)計，全國僅栽培的牡丹品種就達800個以上。由于牡丹異花授粉的特性，種間極易雜交，以及長期引種、選擇的結(jié)果，已很難單從植物的外部形態(tài)上來確定品種的來源、名稱和品種間的親緣關(guān)系，常出現(xiàn)同名異種或同種異名的問題，這些都給準確進行牡丹品種資源的篩選、鑒定和利用帶來了困難。關(guān)于牡丹品種鑒定，過去幾十年里，研究者在形態(tài)學、孢粉學、細胞學等方面做了大量工作。近些年來，許多學者在DNA水平上深入研究牡丹種間、種與品種間及品種群間的相互關(guān)系，揭示出形態(tài)學無法分析解決的方面。利用DNA分子標記技術(shù)，迅速建立起我國牡丹品種的標準指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，對種質(zhì)資源的快速鑒別、種質(zhì)資源知識產(chǎn)權(quán)保護、園藝植物國際登錄、分子標記育種和優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)新等方面將發(fā)揮重要作用。

1.1 RAPD技術(shù)

利用RAPD技術(shù)，陳向明等對35個不同花色牡丹品種親緣關(guān)系進行分析，認為來源相同、花色相同的品種間親緣關(guān)系相對較近，但多數(shù)遺傳組的劃分與花色系列間并未有一致的關(guān)系；Hosoki等對19個牡丹品種親緣關(guān)系進行分析，得出遺傳聚類組的劃分與花色并不完全一致。孟麗等對11個牡丹野生類群和12個栽培品種親緣關(guān)系進行分析，認為與栽培牡丹間親緣關(guān)系從近到遠依次為楊山牡丹、四川牡丹、卵葉牡丹、紫斑牡丹和矮牡丹，RAPD試驗擴增出的25個特異標記可用于牡丹組內(nèi)種間、品種間的分類與鑒定。鄒喻蘋等利用RAPD標記分析了牡丹組種內(nèi)與種間遺傳關(guān)系，結(jié)果與洪德元根據(jù)形態(tài)性狀對該組所做的分類處理基本相符。

1.2 AFLP技術(shù)

AFLP（擴增片段長度多態(tài)性）作為一種分子標記因其具有帶型豐富、用樣量少、靈敏度高、快速高效等特點，已被用于檢測遺傳多樣性、構(gòu)建遺傳圖譜和定位克隆基因、天然居群的遺傳結(jié)構(gòu)與保護生物學研究等方面，成為材料間遺傳多樣性和分類研究的有效手段。袁濤對牡丹7個野生種和32個品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系A(chǔ)FLP分析結(jié)果顯示，野生種的遺傳多樣性明顯高于品種的遺傳多樣性。但是，四川牡丹沒有參與中國栽培牡丹品種群的起源與演化，完全與孟麗的結(jié)論不一致。因此，四川牡丹在栽培牡丹品種群的起源與演化中的地位尚不清楚.侯小改發(fā)現(xiàn)與革質(zhì)花盤亞組與栽培牡丹親緣關(guān)系從近到遠的4個種依次為：楊山牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹和卵葉牡丹，且矮牡丹和卵葉牡丹有較近的親緣關(guān)系，但缺乏四川牡丹。侯小改將30個牡丹品種完全區(qū)分開，多數(shù)選育地相同的牡丹種質(zhì)表現(xiàn)出較為密切的親緣關(guān)系。當其他性狀相差不大時，株高相近的品種間親緣關(guān)系相對較近。李保印等利用AFLP技術(shù)對中原牡丹品種建立了由60個樣本組成的核心種質(zhì)。

1.3 SRAP技術(shù)

相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）是一種新型的基于PCR的標記方法，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros提出。該標記通過獨特的引物設(shè)計對可讀框（open reading frames，ORFs）進行擴增，因個體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。該標記將AFLP和RAPD兩者的優(yōu)點有機的結(jié)合起來，具有簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標片段的特點。SRAP標記是對基因的重要組成部分ORFs進行擴增，基因的多樣性更能反映遺傳資源的多樣性，SRAP標記在這方面的應(yīng)用較為廣泛。

HAO等對29個品種的牡丹進行研究表明，SRAP標記是非常有效的識別牡丹品種和雜交種的標記方法。其鑒定結(jié)果與形態(tài)觀察的結(jié)果一致，且操作簡便，可大大降低引物合成費用，提高引物的使用效率。郭大龍等對影響牡丹SRAP反應(yīng)的各因子進行正交試驗，得到牡丹最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，為SRAP技術(shù)在牡丹育種上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2 基因工程技術(shù)在控制牡丹種質(zhì)創(chuàng)新上的應(yīng)用

牡丹的花期較短，且花期較集中，給牡丹花會的舉辦和人們賞花帶來不便，如何延長牡丹花期成為迫切需要解決的問題。牡丹花屬乙烯敏感型，乙烯的大量產(chǎn)生是牡丹花衰老的主要原因。在高等植物體內(nèi)乙烯的生物合成是由前體物質(zhì)SAM（S一腺苷甲硫氨酸）在ACS（ACC合成酶）和ACO（ACC氧化酶）的催化下形成的，ACS和ACO是乙烯生物合成過程中的2個關(guān)鍵酶。通過ACC氧化酶的反義基因技術(shù)，可望有效抑制乙烯生成，從而延長牡丹花期。楊英軍等通過PCR擴增，已獲得長度約500 bp的片段，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該片段與已知序列同源性為98.2%，表明牡丹ACC氧化酶基因部分序列克隆成功。進一步將克隆到的牡丹ACC氧化酶片段與植物表達載體pBI 121反向連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，成功構(gòu)建了牡丹ACC氧化酶基因的反義表達載體，為進一步通過反義技術(shù)獲得抗衰牡丹資源奠定了基礎(chǔ)。

3 展 望

基因工程技術(shù)在牡丹研究中的應(yīng)用已取得了較大進展，但廣度和深度還有待擴大。國內(nèi)牡丹分子水平的研究主要集中在品種間親緣關(guān)系的研究，在農(nóng)作物育種及轉(zhuǎn)基因花卉方面的研究及應(yīng)用尚處在起步階段。

傳統(tǒng)的育種手段已遠遠滿足不了人們對于牡丹色、香、花期等的新品種需求。由于牡丹組織再生及組培苗馴化存在諸多困難，目前尚無法運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化法進行牡丹轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。

自1987年Meyer獲得轉(zhuǎn)基因矮牽牛以來，花卉基因工程迅速發(fā)展，并已成為花卉育種的新趨勢.花卉基因工程通過抑制內(nèi)源基因或?qū)送庠椿蚨ㄏ蚋脑焯囟ㄐ誀钋也粏适г行誀?，大大縮短了新品種選育的時間；而且可以突破種間不親和的限制，將目的基因引入原來沒有這種基因的物種，從而極大地改良花卉品質(zhì)，甚至創(chuàng)造新品種。

近年來發(fā)展的花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)避開了再生的障礙且操作簡單，已在小麥、大豆等作物上獲得成功?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟為牡丹性狀的分子改良提供了一條全新的思路?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)階段一種潛在的適宜于牡丹的轉(zhuǎn)基因方法。花粉管通道在花柱中的形成是進行花粉管通道法轉(zhuǎn)基因的前提?；ǚ酃茉诨ㄖ械纳L速度因植物種類的不同而差異很大，明確牡丹花粉管形成所需時間，對于牡丹花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究是十分必要的。

[1] 張桂榮.中原牡丹種質(zhì)資源的收集與評價[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（23）：9965-9966.

[2] 郭晨瑛，鄭艷偉，范義榮. 江南牡丹花期調(diào)控試驗研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（8）：3988-3990.

[3] ZOU Y P，CAI M L，WANG Z P.Systematic studies on Paeonia sect.Moutan DC.Based on RAPD analysis[J].Acta Phytotaxonomica Sinica，1999，37（3）：220-227.

[4] 仇 碩，趙 健，張翠萍. 中國野牡丹科觀賞植物種質(zhì)資源的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（22）：9471-9472，9519.

[5] 楊英軍，劉保國，盧軍剛，等. 牡丹ACC氧化酶基因的克隆與反義載體的構(gòu)建[J]. 北方園藝，2008，（5）：187-190.

[6]王燕青，季孔庶. 利用正交設(shè)計優(yōu)化牡丹SRAP-PCR反應(yīng)體系[J]. 分子植物育種，2009，7（1）：199-203.

[7] 郭大龍， 侯小改， 張 靜，等. 牡丹SRAP反應(yīng)體系的建立及正交設(shè)計優(yōu)化[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2008，（12）：113.

[8] 陳向明，鄭國生，孟 麗. 不同花色牡丹品種親緣關(guān)系的RAPD-PCR分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2002， 35：546-551.

[9] Hosoki T， Kimura D， Hasegawa R， et al. Comparative study of Chinese tree peonycultivars by random amplif i ed polymorphic DNA （RAPD）analysis.Scientia Horticulturae， 1997，（70）：67-72.

[10] 孟 麗，鄭國生. 部分野生與栽培牡丹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的RAPD研究[J].林業(yè)科學，2004，40（5）：111-115.

[11] 鄒喻蘋， 蔡美琳， 王子平. 芍藥屬牡丹組的系統(tǒng)學研究——基于RAPD分析[J]. 植物分類學報，1999，37：220-227.

[12]Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J].Theor Appl Genet，2003，107：271- 282.

[13]李保印. 中原牡丹品種遺傳多樣性與核心種質(zhì)構(gòu)建研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學，2007.

[14]侯小改，尹偉倫，李嘉玨，等. 部分牡丹品種遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39（8）：1709-1715.

[15]Tomkins J P， Wood T C， Barnes L S， Westman A， Wing R A.Evaluation of genetic variation in the daylily（Hemerocallis spp.）using AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics， 2001， 102：489-496.

[16]Koopman W J M， Zevenbergen M J，Van Den Berg R G. Species r e l a t i o n s h i p s i n L a c t u c a S.L.（Lactuceae，Asteraceae）inferred from AFLP fingerprints.American Journal of Botany， 2001，88：1881-1887.

[17]袁 濤. 中國牡丹部分種與品種（群）親緣關(guān)系的研究[D].北京：北京林業(yè)大學，1998.

[18]侯小改，尹偉倫，李嘉玨，等. 牡丹矮化品種親緣關(guān)系的AFLP分析[J]. 北京林業(yè)大學學報， 2006， 28（5）：73-77.