余海忠 ，孫永林，廖雪義，王海燕

(襄樊學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄樊 441053)

襄麥冬粗提物抗菌活性初步研究

余海忠 ，孫永林，廖雪義，王海燕

(襄樊學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄樊 441053)

以蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯為溶劑，提取襄麥冬活性物質(zhì)，并分別測定提取物對以下5種病原真菌：立枯絲核菌Rhizoctonia solani，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea，齊整小核菌Sclerotium rolfsii，終極腐霉Pythium ultimum，尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型Fusarium oxysporum f. sp cucumber菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用. 結(jié)果表明襄麥冬的三種溶劑提取物對灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌的菌絲生長均具有較強的抑制作用，而上述相同濃度的提取物對齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型的生長未表現(xiàn)出明顯的抑制效果. 同時，三種溶劑提取物對立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、齊整小核菌、終極腐霉、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型的孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的抑制作用. 其中，襄麥冬乙酸乙酯提取物較蒸餾水和甲醇提取物對病原真菌的生長和孢子萌發(fā)的抑制效果明顯. 乙酸乙酯提取物相對于蒸餾水、甲醇提取物有較好的抑菌效果. 襄麥冬提取物對灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌的菌絲生長和立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、齊整小核菌、終極腐霉、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型的孢子萌發(fā)有良好的抑制作用.

襄麥冬；提取物；抑菌活性；菌絲生長；孢子萌發(fā)

襄麥冬，即湖北麥冬，拉丁學(xué)名Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma，為《中華人民共和國藥典》(1995年，2000年，2005年版)新增品種山麥冬的基原植物之一，其塊根與川麥冬、杭麥冬一樣，中藥處方均作麥冬同等入藥，目前已成為中藥麥冬的主流商品，因主產(chǎn)于湖北襄陽歐廟一帶而俗稱為襄麥冬. 作為道地中藥材，襄麥冬已有40多年的栽培歷史，常年種植面積在3000ha以上，年產(chǎn)量占全國麥冬產(chǎn)量60%以上，居全國三大麥冬產(chǎn)地之首，單產(chǎn)高于川、杭麥冬，品質(zhì)優(yōu)，具有“白、干、凈、勻、大”的特點.

對襄麥冬的研究，目前主要集中在GAP栽培技術(shù)、種質(zhì)鑒別、化學(xué)成分含量測定及藥劑制品的開發(fā)[1-7]上，但對其活性物質(zhì)參與農(nóng)作物病害的防治鮮見報道. 因此，本實驗擬通過對襄麥冬活性物質(zhì)對幾種蔬菜病害的控制展開研究：以襄麥冬塊根不同溶劑提取物為供試藥液，以立枯絲核菌Rhizoctonia solani；灰葡萄孢菌Botrytis cinerea；齊整小核菌Sclerotium rolfsii；終極腐霉Pythium ultimum；尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型Fusarium oxysporum f. sp cucumber為靶標(biāo)病原真菌，采取菌絲生長抑制法和孢子萌發(fā)抑制法，測定襄麥冬提取物對上述病原真菌的生物活性，為更加充分、合理的綜合利用襄麥冬資源，以及為下一步新型植物源殺菌劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 實驗材料

1.1 供試病原真菌

立枯絲核菌R. solani；灰葡萄孢菌B. cinerea；齊整小核菌S. rolfsii；終極腐霉P. ultimum；尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型F. oxysporum f. sp cucumber. 以上五個菌株由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供，實驗室置PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)待用.

1.2 供試植物

襄麥冬L. spicata var. prolifera：采自湖北襄陽歐廟襄麥冬規(guī)范化栽培基地.

1.3 實驗儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱；電子分析天平；冰箱；微量移液器；具塞試劑瓶；培養(yǎng)皿(φ= 90 mm)；超聲波儀；電爐；接種針；搪瓷小托盤；切片機(jī)；漏斗；燒杯；新華1號濾紙；剪刀；血細(xì)胞計數(shù)板；顯微鏡；蓋玻片；無菌毛細(xì)滴管；無菌吸管；無菌鑷子；米尺；砂布；高壓滅菌鍋；三角瓶；小刀.

1.4 藥品與試劑

吐溫-20、甲醇、乙酸乙酯、無水乙醇、葡萄糖、瓊脂粉

2 實驗方法

2.1 PDA的制備

1)每升水中含200g去皮土豆、20g葡萄糖、20g瓊脂粉，不調(diào)PH值. 2)200g土豆去皮，切成土豆丁，加幾百毫升水煮，待水開后，計時30min，稍涼后用砂布過濾，濾液中加入20g葡萄糖，再加水到1000mL. 3)最后分裝到250mL規(guī)格的三角瓶中，每瓶放200mL培養(yǎng)基和4g瓊脂粉. 121℃高壓滅菌20mm. 4)25℃培養(yǎng). 5)不加瓊脂為液體培養(yǎng)基.

2.2 供試真菌的培養(yǎng)

將受試菌株活化后接種于PDA培養(yǎng)基，孵育至有孢子生成.

表1 各種真菌培養(yǎng)條件

2.3 活性物質(zhì)的提取

將新鮮襄麥冬塊根樣品洗凈瀝干后，置于電動恒溫干燥箱內(nèi)60℃烘干至衡重，切片，放于密閉容器中待用.

1)蒸餾水提取 稱取襄麥冬切片100g置于1000mL大燒杯中，以1:10的比例加入蒸餾水，55℃水浴提取1h，重復(fù)提取3次. 然后濾渣再經(jīng)超聲波處理30min后過濾，合并四次濾液，過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)減壓濃縮后得提取物，稱重后置于冰箱保存待用.

2)甲醇提取 稱取襄麥冬切片100g置于1000mL大燒杯中，加入500mL甲醇溶液，置于通風(fēng)櫥55℃水浴加熱1h，重復(fù)提取3次，合并濾液，過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)減壓濃縮后得提取物，稱重置于冰箱保存待用.

3)乙酸乙酯提取 稱取襄麥冬切片100g置于1000mL大燒杯中，加入500mL乙酸乙酯溶液，55℃水浴加熱回流1h，重復(fù)提取3次，合并濾液，過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)減壓濃縮后得提取物，稱重置于冰箱保存待用.

2.4 提取物活性的測定

2.4.1 襄麥冬提取物對病原真菌菌絲生長的抑制試驗[8]

在無菌操作臺中，將襄麥冬塊根浸膏分別用丙酮配成初始濃度為2g/mL、1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL的藥液. 將供試菌種平板培養(yǎng)后用7mm的打孔器打出一定數(shù)量的菌餅備用. 加熱事先已滅菌的PDA，待培養(yǎng)基溶化后，將1mL藥液或丙酮(CK)分別與9mLPDA混勻使總體積達(dá)到10mL，然后趁熱倒入培養(yǎng)皿中制成薄厚均勻的平板. 則處理藥液終濃度分別為 0.2g/mL、0.1g/mL、0.05g/mL、0.025g/mL、0.0125g/mL. 然后用接種針小心將菌餅放置在處理培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，菌絲面向下,每皿接一塊，置于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 接種后24h開始觀測，時間間隔為3h，測量菌落直徑(十字交叉量取2次,取其平均數(shù)). 重復(fù)以上步驟5次. 對五種供試菌種分別定時進(jìn)行測定. 生長抑制率的計算方法:

2.4.2 襄麥冬提取物對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制試驗

用無菌生理鹽水沖洗長滿孢子的培養(yǎng)基，將孢子沖進(jìn)錐形瓶中，用紗布濾去雜質(zhì). 在6個裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中加入1mL孢子懸浮液，其中5瓶分別加入2mL不同濃度襄麥冬提取物，另1瓶加對照液2mL，達(dá)到9：1比例，使藥液終濃度分別為0.002g/mL、0.001g/mL、0.0005g/mL、0.00025g/mL、0.000125g/mL，然后在搖床中培養(yǎng). 孢子萌發(fā)(以孢子芽管長度大于孢子短半徑者為萌發(fā))后，用無菌水稀釋到適當(dāng)濃度(以10×10低倍鏡下，每個視野30～40個孢子為宜)，加到血細(xì)胞計數(shù)板上，在10×10倍顯微鏡下觀測. 重復(fù)以上步驟，對五種供試菌種分別定時進(jìn)行觀測. 孢子萌發(fā)抑制率的計算方法:孢子抑制率(%)=(對照萌發(fā)數(shù)-處理萌發(fā)數(shù))/對照萌發(fā)數(shù)×100%

3 結(jié)果與分析

表2 蒸餾水提取物對病原真菌菌落的抑菌效果

3.1 襄麥冬提取物對病原菌生長的抑制

3.1.1 蒸餾水提取物

蒸餾水提取物對灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌的抑菌作用較弱，最大抑制率分別是 30.29%、27.73%、24.07%. 對齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型未表現(xiàn)出明顯的抑制作用. 同一菌種提取物濃度越高，抑菌作用越明顯. 隨著稀釋比例的增大，抑菌作用逐漸減小.

3.1.2 甲醇提取物

甲醇提取物對灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌均有較明顯的抑菌作用，最大抑制率分別是49.09%，34.08%，32.37%. 對齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型未表現(xiàn)出明顯的抑制作用. 同一菌種提取物濃度越高，抑菌作用越明顯. 隨著稀釋比例的增大，抑菌作用逐漸減小.

表3 甲醇提取物對供試驗病原真菌菌絲生長的抑制效果

表4 乙酸乙酯提取物對供試驗病原真菌菌絲生長的抑制效果

3.1.3 乙酸乙酯提取物

乙酸乙酯提取物對灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌均有明顯抑制作用. 最大抑菌率分別是50.41%、39.39%、34.88%. 對齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型未表現(xiàn)出明顯抑制作用. 同一菌種提取物濃度越高，抑菌作用越明顯. 隨著稀釋比例的增大，抑菌作用逐漸減小.

3.2 襄麥冬提取物對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制試驗

由表5～7可知，襄麥冬的三種溶劑提取物，對灰葡萄孢菌、立枯絲核菌、終極腐霉、齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型五種真菌的孢子萌發(fā)都具有一定的抑制作用. 并且隨著提取物濃度的降低，抑制作用也逐漸降低.

3.2.1 蒸餾水提取物

蒸餾水提取物對灰葡萄孢菌、立枯絲核菌、終極腐霉、齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型五種真菌的孢子萌發(fā)均具有較弱的抑制作用. 對上述五種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制率分別是78.57%、70.00%、69.23%、59.26%、48.48%.

表5 蒸餾水提取液對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制效果

3.2.2 甲醇提取物

甲醇提取物對灰葡萄孢菌、立枯絲核菌、終極腐霉、齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型五種真菌的孢子萌發(fā)均具有較明顯的抑制作用. 對上述五種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制率分別是91.30%、90.00%、80.95%、78.95%、63.64%.

3.2.3 乙酸乙酯提取物

乙酸乙酯提取物對灰葡萄孢菌、立枯絲核菌、終極腐霉、齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型五種真菌的孢子萌發(fā)均具有明顯的抑制作用. 對上述五種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制率分別是 95.24%、90.48%、89.47%、85.71%、78.26%.

表6 甲醇提取液對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制效果

表7 乙酸乙酯提取物對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制試驗

4 小結(jié)

為了探究湖北道地藥材襄麥冬在農(nóng)業(yè)抑菌方面的潛力，本文首次室內(nèi)測定了其不同溶劑提取物對病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響. 結(jié)果表明：1)三種溶劑提取物對灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌的菌絲生長均具有較強的抑制作用，而上述相同濃度下的提取物對齊整小核菌、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型的生長未表現(xiàn)出明顯的抑制效果. 2)三種溶劑提取物對立枯絲核菌、灰葡萄孢菌、齊整小核菌、終極腐霉、尖鐮孢菌黃瓜轉(zhuǎn)化型的孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的抑制作用. 其中，無論是對菌絲生長還是孢子萌發(fā)，乙酸乙酯提取物都較蒸餾水和甲醇提取物的抑制效果明顯. 與另外二種溶劑相比乙酸乙酯極性最小，因此，筆者推測此種現(xiàn)象是否與活性成分的極性有關(guān).

本文對襄麥冬提取物抑菌活性進(jìn)行了初步測試，顯示了其可觀的殺菌潛力，為開發(fā)新型天然殺菌劑提供了新的思路，對襄麥冬的綜合開發(fā)利用亦有著重要意義. 但是，本實驗只采用了少數(shù)幾種微生物作為靶標(biāo)病菌，襄麥冬活性成分到底具有多寬的殺(抑)菌譜？最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)又各是多少？襄麥冬提取物是混合物，究竟是哪一種或幾種其它成分參與抑菌？活性成分對微生物的抑制作用機(jī)制又是怎樣？活性成分的穩(wěn)定性(熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、抗氧化性等)又如何？以上問題都有待進(jìn)一步深入研究.

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Antifungal Activity of Crude Extracts of Liriope spicata (Thunb.) Lour. Var. prolifera Y. T. Ma

YU Hai-zhong, SUN Yong-lin, LIAO Xue-yi, WANG Hai-yan
(School of Chemical Engineering and Food Science, Xiangfan University, Xiangfan 441053, China)

The study aims to provide theory basis for the development and improvement of the utinization rate of Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma. The active substances of Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma were extracted respectively by using distilled water, methanol and ethyl acetate as solvents, and the inhibitory activity of the extracts against mycelia growth and spore germination were measured against the five pathogenic fungi, which were Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum, Fusarium oxysporum f.sp cucumber. whereas the extracts by three different solvents had significant inhibitory activity against the mycelia growth of Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, they had little such activity against the mycelia growth of Sclerotium rolfsii and Fusarium oxysporum f.sp cucumber. And they had certain inhibitory activity against the spore germination of all the five fungi. Among which, the inhibitory activity of the extract by ethyl acetate against the mycelia growth and spore germination was significantly higher than the other two ones. It can be concluded that the extracts by ethyl acetate had better antifungal activity than the other two ones. And the extracts had significant inhibitory activity against the mycelia growth of Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, along with their activity against the spore germination of all the five fungi.

Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma; Extracts; Antifungal activity; Mycelia growth; Spore germination

S482.2

A

1009-2854(2010)05-0020-05

2010-04-08

湖北省教育廳優(yōu)秀中青年人才項目(Q20082504); 襄樊科技局科技攻關(guān)項目(200517); 湖北省高等學(xué)校產(chǎn)學(xué)研項目(CD092501); 襄樊學(xué)院重大科研項目(Zdky200905)

余海忠(1976— ), 男, 湖北棗陽人, 襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院講師.

徐 杰)