王 宇，安貴杰，喻 芳，牛莉娜，饒朗毓，裴 華*

（1.海南醫(yī)學(xué)院2007級(jí)生物技術(shù)，海南 ?？?571101；

2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101）

·論 著·

分離鑒定一株具有免疫活性的海南紅樹林真菌

王 宇1，安貴杰1，喻 芳1，牛莉娜2，饒朗毓2，裴 華2*

（1.海南醫(yī)學(xué)院2007級(jí)生物技術(shù)，海南 海口 571101；

2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101）

目的 初探菌株P(guān)H0038發(fā)酵液的免疫增強(qiáng)活性，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。方法 以人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖為指標(biāo)，利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)菌株的免疫活性。從菌株的菌落特征、形態(tài)特征、rDNA ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)菌株P(guān)H0038進(jìn)行鑒定。結(jié)果 PH0038的發(fā)酵液凍干成粉后，進(jìn)行人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性，通過各種指標(biāo)鑒定菌株P(guān)H0038為Penicillium sp.LF41。結(jié)論 菌株P(guān)H0038的發(fā)酵液可能對(duì)人體免疫系統(tǒng)有免疫增強(qiáng)效果。

真菌；免疫活性；鑒定

菌株P(guān)H0038是從海南省東塞港紅樹林國(guó)家自然保護(hù)區(qū)灘涂地的淤泥內(nèi)分離得到的一株絲狀真菌，經(jīng)鑒定為Penicillium sp.LF41。海洋真菌能產(chǎn)生豐富多樣的生物活性物質(zhì)，因其生存環(huán)境條件惡劣，具有高鹽、高壓、低溫、低照、寡營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn)，使海洋生物產(chǎn)生了與陸地生物不同的代謝系統(tǒng)和防御體系，從而產(chǎn)生了相當(dāng)部分陸地所沒有的生物活性物質(zhì)[1]。且其生物活性表現(xiàn)在能廣泛刺激機(jī)體的特異性和非特異性免疫反應(yīng)，改善機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高自體免疫力[2]。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 土壤樣品來源 海南省文昌市清瀾港紅樹林區(qū)表土下5-20cm深度的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 選擇性分離培養(yǎng)基：海水馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基。發(fā)酵種子培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基：含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.1.3 人外周血來源 從健康成人中隨機(jī)抽取2ml EDTA-K2抗凝靜脈血液。

1.2 方法

1.2.1 土樣的處理與菌株的分離純化 稱取10g土壤樣本加入含100ml無菌陳海水的錐形瓶中，充分振蕩混勻后靜置，取樣本上清制備成10-2-10-4的不同稀釋度，各取100μl涂布于分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，持續(xù)觀察，挑取單菌落于海水馬丁氏培養(yǎng)基平板中劃線純化，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，排除相同菌株。以上操作在無菌環(huán)境下進(jìn)行。

1.2.2 制備發(fā)酵上清液 取單菌落接種于發(fā)酵種子培養(yǎng)基，28℃，250r/min搖床培養(yǎng)5d，4℃3000r/min離心10min，取上清以0.22μm孔徑濾膜過濾后備用。

1.2.3 活性菌株篩選 采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)樣品對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖效果。無菌條件下分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整濃度，使96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔中加入人外周血單個(gè)核細(xì)胞1×105個(gè)。在待測(cè)樣本孔中加入經(jīng)稀釋后10-2濃度發(fā)酵培養(yǎng)液100μl，陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)加入含5μg/ml PHA基礎(chǔ)培養(yǎng)液100μl，陰性對(duì)照孔內(nèi)加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液100μl，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)72h后，加入含5mg/ml MTT基礎(chǔ)培養(yǎng)液20μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)。4h后棄培養(yǎng)上清，每孔中加入100μl DMSO，振蕩器振搖10min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，630nm參比波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 葡聚糖凝膠分離實(shí)驗(yàn) 取葡聚糖凝膠G-259-10g，純水浸泡（4℃）過夜。取600mm×15mm層析柱，將泡發(fā)后G-25澆注，一次成型。取樣本10ml，以純水為上樣液，肉眼觀察樣本走進(jìn)柱后，收集下滴液棄去前10ml收集液。加上樣液140ml，每7ml為1管，共收集20管，將收集物進(jìn)行冷凍干燥。對(duì)冷凍干燥成份再次應(yīng)用人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖刺激進(jìn)行活性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 菌株P(guān)H0038的分類鑒定 采用菌落形態(tài)和顯微鏡涂片觀察，同時(shí)，結(jié)合分子生物學(xué)手段對(duì)菌株P(guān)H0038進(jìn)行鑒定。

菌落形態(tài)特征：在馬丁氏瓊脂平板上點(diǎn)植，28℃倒置培養(yǎng)。觀察并記錄菌落性狀、大小、是否產(chǎn)色素等[3]。

個(gè)體形態(tài)：采用革蘭氏染色法觀察菌株的形態(tài)特征。用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲大小、形狀、表面特征及是否有橫隔，孢子大小、形狀、類型、顏色等，對(duì)照真菌鑒定手冊(cè)[4]，確定菌株的種屬地位。

1.2.6 rDNA ITS序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析 基因組DNA的提取：直接用菌落PCR擴(kuò)增目的DNA。

rDNA ITS序列擴(kuò)增、測(cè)序：采用真菌通用引物，ITS-1和ITS-4。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，57℃退火40s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。測(cè)序工作由華大基因完成。

系統(tǒng)發(fā)育分析：將測(cè)序獲得rDNA ITS序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)，并利用www.ebi.ac.uk生物信息網(wǎng)站上的Clustalw軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株的MTT篩選及活性檢測(cè)結(jié)果 菌株P(guān)H0038經(jīng)葡聚糖凝膠處理后，獲得的第5管收集液有明顯的顯色成份，其凍干物呈淡黃色粉末狀。將凍干后產(chǎn)物再次應(yīng)用外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖刺激實(shí)驗(yàn)測(cè)定，有明顯的促進(jìn)增殖效果。如表1。

2.2 菌株P(guān)H0038的分類鑒定

表1 MTT法檢測(cè)葡聚糖凝膠分離后的有效產(chǎn)物對(duì)單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響（±s)

表1 MTT法檢測(cè)葡聚糖凝膠分離后的有效產(chǎn)物對(duì)單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響（±s)

注：*待測(cè)樣本與正常對(duì)照組比較P＜0.05。**待測(cè)樣本與陽(yáng)性對(duì)照組比較P＜0.05。

分組 第1次 第3次正常對(duì)照樣本陽(yáng)性對(duì)照0.229±0.0130.494±0.007*0.502±0.016**0.210±0.0080.482±0.006*0.513±0.018**

2.2.1 菌落形態(tài) 菌落呈圓形，綠色，表面為絨狀，菌落背面培養(yǎng)基顯褐色。

2.2.2 顯微形態(tài)特征 菌株呈革蘭氏陰性，光學(xué)顯微鏡下，菌絲有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，光滑。菌絲細(xì)胞垂直生出，近頂囊處稍膨大；頂囊短柱形,從頂囊的1/2至2/3處生出小梗，小梗雙層，平行密集于頂囊頂部；分生孢子串生于小梗頂端,成輻射狀排列或成柱形；分生孢子表面光滑無棘，球形或近球形。

2.2.3 rDNAITS序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析rDNA提取和PCR擴(kuò)增：采用菌落PCR直接進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條約571bp大小的條帶。

rDNA ITS序列分析：將該序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的真菌rDNA進(jìn)行Blast分析,結(jié)果表明,與PH0038菌株rDNA ITS序列間相似性較高的序列主要分布于青霉屬，其中與之相似性最高的是青霉菌Penicillium sp.LF41，相似性為99%，由此推斷菌株P(guān)H0038可能是青霉屬中的一個(gè)種。

PH0038的rDNA ITS：序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建將測(cè)得的rDNA ITS序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析，獲得同源序列，從中挑取同源性高的18個(gè)菌的rDNA ITS序列，在www.ebi.ac.uk生物信息網(wǎng)站運(yùn)用Clustalw軟件構(gòu)建包括相關(guān)種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1，可知菌株P(guān)H0038與Penicillium sp.LF41親緣關(guān)系最近。

圖1PH0038rDNA ITS序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株P(guān)H0038的菌落形態(tài)特征及顯微形態(tài)與青霉菌極為相近。rDNA ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株P(guān)H0038與青霉菌Penicillium sp.LF41親緣關(guān)系最近，相似性為99%,由此鑒定菌株P(guān)H0038為Penicillium sp.LF41。

3 討 論

對(duì)菌株P(guān)H0038的發(fā)酵液經(jīng)葡聚糖凝膠初步分離后，做凍干處理，將凍干粉再次進(jìn)行人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效果?？梢?，從紅樹林特殊生態(tài)環(huán)境下分離得到的真菌，其活性物質(zhì)為分泌型產(chǎn)物，體外實(shí)驗(yàn)有明顯的免疫增強(qiáng)作用。

近年來，國(guó)內(nèi)研究者對(duì)真菌的研究范圍多集中于陸生真菌，尤其是大型食用真菌[5]，且活性物質(zhì)主要來源于菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[6]，對(duì)于可能存在于微生物分泌物中的代謝產(chǎn)物研究較少[7]。菌株P(guān)H0038經(jīng)形態(tài)學(xué)、基因測(cè)序鑒定為Penicillium sp.LF41，為青霉屬，且國(guó)內(nèi)外均未見關(guān)于青霉菌的免疫增強(qiáng)作用的報(bào)道。目前，我們正在對(duì)PH0038菌株的免疫活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將另文報(bào)道。

[1]王祥敏,李 明,駱祝華,等.海洋真菌及其生物活性物質(zhì)多樣性研究[J].海洋湖沼通報(bào),2007,3:69-74.

[2]李師鵬,安利國(guó).真菌多糖免疫活性的研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng),2001,20(4):581-587.

[3]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979:495.

[4]吳碧文,胡永華,方 哲,等.抗MRSA海綿真菌的分離及菌株W0707的鑒定[J].中國(guó)海洋藥物雜志,2006,25(1):39-43.

[5]吳新君,毛培宏,金 湘,等.食(藥)用真菌多糖的研究[J].化學(xué)與生物工程,2004,21（1）:14-16.

[6]馮 焱.真菌多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)能的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2003,19(5):24-26.

[7]熊 楓,鄭忠輝,黃耀堅(jiān),等.從深海沉積物中篩選具有抗菌、抗腫瘤活性的海洋真菌[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào),2006,45(3):419-423.

Isolation of mangrove endophytic fung with immunocompetence and identification of the strain PH0038.

WANGYu,AN Gui-jie,YU Fang,et al,School of Natural Sciences,Hainan Medical College,Haikou571101,Hainan,CHINA

Objective To identify the strain PH0038with better immune activities.Methods The immunocomptence was assayed by MTT method with peripheral blood mononuclear cells proliferation as indicator,the strain PH0038was identified by culture characteristics,morphological characteristics,rDNA ITS sequence and phylogenetic analysis.Results one fungu PH0038presents strong immunocomptence.The identification study indicated that PH0038was Penicillium sp.LF41.Conclusion The strain PH0038could enhance the human’s immune system.

Fungi;Immunocomptence;Identification

R379

A

1003—6350（2010）22—019—03

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：309032）

王 宇(1989—)，女，內(nèi)蒙古喀喇沁旗人，在讀本科生。

*通訊作者：裴 華。E-mail：phzmh61@sohu.com

2010-10-15）