周漪波，黃芳，朱志鑫，鄧欣

（中國廣州分析測試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510070）

小麥粉中偶氮甲酰胺的高效液相色譜法快速測定

周漪波，黃芳，朱志鑫，鄧欣

（中國廣州分析測試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510070）

建立用高效液相色譜（HPLC）測定小麥粉中的偶氮甲酰胺的測定方法。樣品經(jīng)丙酮超聲振蕩提取，高效液相色譜分離，紫外檢測器定性定量。試驗優(yōu)化樣品提取方法和色譜條件，色譜柱為Kromasil C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動相A為10 mmol/L H2SO4水溶液和甲醇，采用梯度洗脫，進樣量5 μL;檢測波長245 nm；流速0.8 mL/min。相對標準偏差小于7.6，回收率在85%～87%之間，檢出限為1.0 mg/kg遠低于國家標準45 mg/kg的限量規(guī)定。本方法簡單快捷，已應(yīng)用于小麥粉中ADA的快速測定。

小麥粉；偶氮甲酰胺；高效液相

偶氮甲酰胺（Azodicarbonamide），簡稱 ADA，分子式為C2H4N2O4，分子量為116，為黃色至橘紅色結(jié)晶性粉末，具有在低用量下實現(xiàn)安全快速氧化的效能，能改善面團的物理操作性質(zhì)和高筋力面團所需的組織結(jié)構(gòu)，適用于做小麥粉處理劑和焙烤食品的快速發(fā)酵劑[1-2]，是溴酸鉀的理想替代產(chǎn)品，在國內(nèi)外已獲得廣泛應(yīng)用，并已通過WHO和FDA的批準。

由于偶氮甲酰胺屬于堿性物質(zhì)，如果在食品中超量使用，可能會對人體的腸胃和肝臟造成損害。ADA在高溫下分解產(chǎn)生氣體發(fā)泡，同時會生成有毒物質(zhì)鹽酸氨基脲（SEM）[3-5]，歐盟于2004年1月6日發(fā)布了2004/1/EC指令，暫停ADA作為發(fā)泡劑在食品中的使用，我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》（GB2760-2007）規(guī)定其在小麥粉中的最大使用量為45 mg/kg。雖然我國和歐盟都限制了ADA的使用，但并沒有制定相應(yīng)檢測標準，甚至連關(guān)于ADA的檢測方法方面的研究也鮮于報道。

采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，建立了小麥粉中ADA的快速檢測方法，并對不同的前處理方法和色譜條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：該方法樣品處理簡單快速，測定結(jié)果準確可靠，檢出限達到1.0 mg/kg，遠低于國標的要求。本方法已成功應(yīng)用于小麥粉中偶氮甲酰胺的快速測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜（帶自動進樣器）配紫外檢測器：美國Agilent公司；As3120超聲波振蕩器：Auto Science公司；TDL-40B離心機：Anke公司。

偶氮甲酰胺標準品溶液：取偶氮甲酰胺對照品（濃度大于99%），用丙酮配制成1000 mg/L標準儲備液，使用時再用溶劑逐級稀釋至所需濃度。標準儲備液置于冰箱內(nèi)可保存1年；水為去離子水；乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亞砜均為分析純：廣州化學(xué)試劑廠；濾膜（0.45 μm，有機相）。

1.2 樣品處理方法

準確稱取面粉約1 g（精確到0.001 g）于10 mL容量瓶中，加入丙酮8 mL，超聲振蕩10 min，加入丙酮定容至10 mL，4000 r/min離心15 min，取上清液2 mL通過有機相濾膜并裝于進樣瓶，待上機分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Kromasil C18，5 μm，4.6×250 mm；流動相：A為10 mmol/L H2SO4水溶液，B為甲醇，采用梯度洗脫，0～7 min為A 100%，7.1 min～10 min為A 0%；進樣量5μL;檢測波長245 nm；流速0.8 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

試驗考察甲醇-水，甲醇-0.05%KH2PO4緩沖液，甲醇-10 mmol/L H2SO4水溶液3種不同的流動相體系，結(jié)果表明：甲醇-H2SO4水溶液體系的洗脫效果最好，加入少量H2SO4可以改善峰形，防止峰的拖尾，有利于提高分離度[6]。由于在此波長處丙酮有吸收且出峰在目標峰后面，為了盡快將溶劑及雜質(zhì)趕出，采用梯度洗脫方式。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 不同提取溶劑提取效果的比較

由于偶氮甲酰胺極性較強，幾乎不溶于水和大多數(shù)有機溶劑,微溶于二甲基亞砜，易溶于N,N-二甲基甲酰胺。比較了用丙酮、二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺等作為提取劑的提取效果。在1.0 g小麥粉中加入50 mg/kg的ADA標準溶液1 mL，浸泡2 h后分別用丙酮、二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺進行超聲波振蕩提取，按前述方法測定ADA回收率（見表1）。結(jié)果表明：以丙酮作為提取溶劑回收率最高，因此，本試驗選擇丙酮提取溶劑。

2.2.2 不同提取溶劑提取效果的干擾效果比較

圖1為采用丙酮作為提取溶劑提取的HPLC色譜圖。

表1 丙酮、二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺提取效果對比Table1 Comparisonoftheextractionrateofacetone,dimethyl sulfoxideandN,N-dimethylformamide

由圖1可以看出，丙酮提取的HPLC圖干擾物少，易于定量，這是由于小麥粉中脂溶性的干擾物質(zhì)很少，水溶性雜質(zhì)較多，以丙酮作為提取溶劑，可以達到減小干擾的目的。所以選用丙酮作為提取溶劑。

2.3 提取方式和時間的選擇

2.3.1 提取方式的選擇

考察了索氏提取與超聲波兩種不同提取方法對ADA提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)二者效果相差甚微，且均能達到定量回收要求?？紤]到索氏提取耗時長溶劑消耗大，超聲波振蕩提取方法能夠達到提取完全的要求，固采用超聲波振蕩法提取。

2.3.2 提取時間的選擇

以加標50 mg/kg的面粉為研究對象，分別超聲提取5、10、15 min提取2次，經(jīng)比較，以上不同樣品提取時間測得偶氮甲酰胺的檢測濃度分別為：39.5、43.2、43.3 mg/kg。試驗結(jié)果表明，以丙酮作為萃取溶劑進行超聲振蕩提取10 min后其回收率就可達86.4%，且延長時間也不能對提取率有明顯的提高。

綜上所述，確定樣品的前處理條件為2.2節(jié)所述。由于采用了HPLC法可以達到理想分離效果，故樣品提取后無需凈化即可直接上機分析，簡便快速，回收率較高。

2.4 線性范圍、線性方程、檢出限

取ADA標準儲備液逐級稀釋成1.0、10、50、100和500 mg/L系列標準溶液，以色譜法面積（A）和質(zhì)量濃度（ρ mg/L）做工作曲線，線性方程為 A=2.87ρ-3.27，r=0.9998，在1.0 mg/L～500 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，以取樣量1.0 g計，本法對樣品的檢出限為1.0 mg/kg，遠低于國標規(guī)定的45 mg/kg的限量，可滿足小麥粉中ADA測定的要求。

2.5 方法的回收率和精密度

取不含ADA的小麥粉樣品，分別加入3種不同水平的ADA標準溶液，浸泡2 h以上后測定ADA的回收率，每個樣品平行測定5次，結(jié)果見表2。

表2 樣品中ADA測定的回收率及相對標準偏差Table2 RecoveryandRSDofADAinthesamples

由表2可知，樣品中ADA的回收率在85%～87%之間，相對標準偏差在3.2%～7.6%之間。

2.6 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法測定了20批次市售小麥粉中的ADA，多數(shù)樣品未檢出ADA，只有2個樣品檢出含有ADA（市售樣品檢出ADA色譜圖見圖2），而且其含量都低于0.045 g/kg。

3 結(jié)論

本文建立了用高效液相色譜（HPLC）測定小麥粉中的偶氮甲酰胺的方法，方法簡單快捷，靈敏度高，已應(yīng)用于小麥粉中ADA的測定。

[1]王遠成，任凌云，張鵬濤.偶氮甲酰胺對面粉粉質(zhì)及面包質(zhì)量的影響[J].中國糧油學(xué)報,2001,16(2):32-35

[2]王遠成.一種新型面粉改質(zhì)劑-偶氮甲酰胺[J].陜西糧油學(xué)報,1994,19(2):21

[3]Cooper K A,Samsonova J V,Plumpton L，et al.Enzyme immunoassay for semicarbazide-the nitrofuran metabolite and food contaminant[J].Analytical Chimica Acta,2007,502(1):64-71

[4]Noonan G O,Begley T H,Diachenko G W.Semicarbazide formation in flour and bread[J].Journal of Agricultual and Food Chemistry,2008,56(6):2064-2067

[5]Becalski A,Lau B P Y,Lewis D，et al.Semicarbazide formation in azodicarbonamide-treated flour:A model study[J].Journal of Agricultual and Food Chemistry,2004,52(18):5730-5734

[6]李發(fā)美.醫(yī)藥高效液相色譜技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1998:50-52

Rapid Determination of Azodicarbonamide in Wheat Flour Using High-performance Liquid Chromatography

ZHOU Yi-bo,HUANG Fang,ZHU Zhi-xin,DENG Xin
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for dangerous Chemical，China National Analytical Center，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

A method was established for the determination of azodicarbonamide （ADA）in wheat using high performance liquid chromatography（HPLC）.ADA in wheat was extracted by sonication with acetone,separated by HPLC,then qualitative and quantitative assessment using ultraviolet detector（UVD）.The conditions of extractionwereoptimized.Theoptimizedchromatographyconditionswere:KromasilC18column（250mm×4.6mm，5 μm）with methanol and 10 mmol/L sulphuric acid water solution as the mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min.The recovery of ADA was in the range of 85%-87%and the RSD was less than 7.6%.The limit of detection was 1.0 mg/kg.The method was proved to be simple and accurate,and has been applied to the determination of ADA in wheat.

wheat；azodicarbonamide;HPLC

周漪波（1981—），男（漢），助理工程師，學(xué)士，主要從事食品安全方面的研究。

2009-08-03