張玉嬋 ，劉金福 ，張平平 ，江英 ，龐紅勛

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津 300384）

苦瓜莖、葉中皂苷類物質(zhì)的提取及分離純化

張玉嬋1，2，劉金福2，*，張平平2，江英1，龐紅勛1，2

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津 300384）

苦瓜莖、葉中含有豐富的皂苷類物質(zhì)。在浸提溫度為70℃，浸提時(shí)間3 h，浸提溶劑為60%乙醇溶液，料液比1∶15，對(duì)60目的原料浸提兩次，測(cè)得苦瓜莖、葉總皂苷的含量分別為2.92%和6.90%，提取率分別為5.9%和13.6%，粗提物中總皂苷的含量分別為49.5%和50.1%。粗提物經(jīng)兩次AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離純化后，苦瓜莖、葉提取物中皂苷純度分別達(dá)到83.4%和86%，經(jīng)HPLC分析，主要有2種皂苷成分。

苦瓜莖葉；皂苷；提取；純化

苦瓜（Momordicac harantia L.）別名錦荔枝、涼瓜、癲蛤蟆、紅羊、癲葡萄，是葫蘆科苦瓜屬蔓性草本植物，苦瓜性味苦寒，具有清熱解毒、滋養(yǎng)強(qiáng)壯、抗腫瘤[1]以及提高人體免疫力[2-3]等功效。近十年來(lái)對(duì)苦瓜皂苷的研究比較多，研究表明，苦瓜的醇提物，水提物均含有皂苷類物質(zhì)，具有降血糖等功效[4-6]。但是大部分的研究都是以苦瓜的果實(shí)，果肉或種籽為原料，對(duì)苦瓜莖葉中皂苷類物質(zhì)的提取及功效的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。植物莖葉中往往含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，并具有明顯的生物活性，如沙棘黃酮[7-9]、苦蕎黃酮[10-11]、銀杏莖葉黃酮[12-13]等等。本研究對(duì)苦瓜莖葉中的皂苷類物質(zhì)進(jìn)行提取、純化，并測(cè)定其含量，為對(duì)其生物活性進(jìn)行研究，對(duì)廢棄的莖葉進(jìn)行深度的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料和儀器

1.1 材料

苦瓜莖葉：產(chǎn)于天津西青區(qū)大寺設(shè)施農(nóng)業(yè)大棚，秋季拉秧后采收，陰干、粉碎過(guò)60目篩，裝袋后常溫貯存；人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品：上海同田生物技術(shù)有限公司；大孔吸附樹(shù)脂（型號(hào)為AB-8）：河北滄州遠(yuǎn)威化工有限公司；乙醇、冰乙酸、高氯酸、氯仿、甲醇、等均為國(guó)產(chǎn)分析純：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

1.2 儀器

Agilent高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；FD-1C冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DL-180A超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；SHB-111循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-50：上海申生科技有限公司；DBS-100自動(dòng)部分收集器：上海滬西儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；恒溫?fù)u床：上海智城分析制造有限公司；FA2004電子天平：上海精科儀器；恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；10μL～100μL，20μL～200 μL，100μL～1000 μL Finnpipette移液槍各1支。

2 方法

2.1 苦瓜莖、葉中皂苷類物質(zhì)的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取香草醛2.5 g于小燒杯中，用冰乙酸多次溶解，定容到50 mL容量瓶中。即為5%的香草醛-冰乙酸溶液。

精密稱取干燥至恒重的人參皂苷Rg1對(duì)照品5mg，加甲醇溶液定容到5 mL，搖勻，作為對(duì)照品溶液，即1 mg/mL的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)皂苷溶液 0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL于藥劑瓶水浴揮干溶劑，加5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和0.8 mL高氯酸，搖勻，60℃水浴加熱15 min。取出后立即流水冷卻10 min,加入5 mL冰乙酸稀釋，靜置20 min后，在波長(zhǎng)468 nm處測(cè)吸光度，甲醇溶液隨行空白對(duì)照，以吸光度A為縱坐標(biāo)，人參皂苷取樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）,得曲線方程：y=0.0017x-0.0026

2.1.2 苦瓜皂苷含量的測(cè)定

將苦瓜粗提液濃縮除醇后，吸取一定量的濃縮液，同圖1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后，在波長(zhǎng)468 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總皂苷的量。

2.1.3 皂苷的HPLC分析

將上述苦瓜皂苷溶于色譜甲醇，配成5 mg/mL的甲醇溶液，以HPLC分析，在203 nm檢測(cè)，色譜條件：色譜柱：Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈：水=30：70，等度洗脫；流速：1 mL/min；柱溫：30℃。

2.2 皂苷的提取與純化

2.2.1 工藝過(guò)程

苦瓜莖、葉自然干燥→粉碎→乙醇浸提→過(guò)濾→濃縮→調(diào)整pH→大孔樹(shù)脂吸附→洗脫→濃縮→真空干燥

2.2.2 具體操作

2.2.2.1 苦瓜莖中皂苷的提取

稱取苦瓜莖1.1 kg，加15 L 60%乙醇于70℃下浸提3 h，過(guò)濾，再加10 L 60%乙醇與70℃下浸提3 h，過(guò)濾，合并兩次濾液得到浸出液13 L,真空濃縮，得到苦瓜莖皂苷粗提液2.6 L。吸取80 μL，按上述繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后，在波長(zhǎng)468 nm處測(cè)定吸光值，3次取平均值，按公式計(jì)算總皂苷含量，粗提液干燥后計(jì)算提取率。

2.2.2.2 苦瓜葉中皂苷的提取

稱取苦瓜葉（干葉）1.2kg，加15L60%乙醇與70℃下浸提3h，過(guò)濾，再加12L60%乙醇與70℃下浸提3h，過(guò)濾，合并兩次濾液得到浸出液19.5 L,真空濃縮，得到苦瓜葉皂苷粗提液4 L。吸取50 μL，按上述繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后，在波長(zhǎng)468 nm處測(cè)定吸光值，3次取平均值，按公式計(jì)算總皂苷含量，粗提液干燥后計(jì)算提取率。

2.2.2.3 皂苷的柱層析純化

本試驗(yàn)采用直徑為100 mm，高2 m的吸附柱進(jìn)行純化，大孔吸附樹(shù)脂為AB-8型，柱裝填體積為8 L。

上樣量：苦瓜莖提取物上樣量為5.3 L；苦瓜葉提取物上樣量為5 L。

上樣液pH值：苦瓜莖提取物上樣pH6.2；苦瓜葉提取物上樣pH7.0。

上樣液濃度：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，苦瓜莖提取物上樣濃度為14.2 mg/mL；苦瓜葉提取物上樣濃度為16 mg/mL。

上樣液速度：苦瓜莖、葉提取物均為20 mL/min。

洗脫劑及其濃度：本試驗(yàn)選擇水和乙醇作為苦瓜皂苷的洗脫劑，據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇80%的乙醇溶液作為苦瓜皂苷的洗脫劑。

洗脫劑量：將上述飽和的樹(shù)脂柱進(jìn)行水洗除雜至Molish反應(yīng)為陰性，收集除雜液，再用80%的乙醇以20 mL/min的速度洗脫，用2倍柱床體積的80%的乙醇溶液洗脫皂苷時(shí)幾乎全部被吸附皂苷都可以洗脫下來(lái)。因而確定洗脫劑用量為2倍柱床體積的80%的乙醇溶液。

2.2.3 提取率、含量、純度及收得率計(jì)算

苦瓜莖、葉皂苷的提取率=提取物/苦瓜莖、葉質(zhì)量×100%

皂苷的含量=粗提物中總皂苷含量/苦瓜莖、葉質(zhì)量×100%

皂苷的純度=粗提物中總皂苷含量/粗提物干重×100%

收得率=純化后總皂苷量/粗提物中總皂苷量×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 苦瓜莖、葉中皂苷類物質(zhì)的提取及含量

苦瓜莖、葉中皂苷類物質(zhì)的提取率及含量見(jiàn)表1。

表1 苦瓜莖、葉中皂苷類物質(zhì)的提取率及含量Table1 The content and rate of extractive saponins from the stem and leaf of Momordica charatia L.%

由表1可知，在苦瓜莖葉中含有豐富的皂苷類物質(zhì)，尤其是苦瓜葉中，含量高達(dá)6.90%（干葉），莖葉中平均含量也達(dá)到了4.90%左右。按照本實(shí)驗(yàn)室確定的提取工藝和技術(shù)條件，苦瓜莖葉中皂苷粗提物提取率分別為5.90%和13.60%，其中總皂苷的含量都達(dá)到了50%左右，可見(jiàn)，被廢棄的苦瓜莖葉具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

3.2 苦瓜莖、葉皂苷純化結(jié)果

從苦瓜莖和葉中提取的皂苷經(jīng)過(guò)兩次大孔樹(shù)脂的純化后，對(duì)其純度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 苦瓜莖、葉提取物柱層析純化效果Table2 The purification effect of extractive saponins from the stem and leaf of Momordica charatia L.%

經(jīng)2次AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離純化，苦瓜莖葉提取物中皂苷的純度得到了大幅度的提高，苦瓜莖提取物皂苷純度為83.40%，葉提取物皂苷純度為86.00%。但收得率僅為11.20%和11.50%，說(shuō)明AB-8大孔吸附樹(shù)脂只對(duì)苦瓜莖葉中個(gè)別的皂苷吸附能力較強(qiáng)，或洗脫時(shí)大部分極性較大的皂苷類物質(zhì)被水洗掉，未被回收。

3.3 HPLC分析結(jié)果

對(duì)大孔吸附樹(shù)脂純化后的苦瓜莖葉中皂苷的組成，與人參皂苷中的Rg1和Rb1標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照，進(jìn)行了HPLC分析，分別精密吸取兩種對(duì)照品溶液各20 μL，按照2.1.3色譜條件重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于3%。表明儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)圖2～圖6。

純化后的苦瓜莖葉中皂苷類物質(zhì)經(jīng)泡沫試驗(yàn)和顯色試驗(yàn)進(jìn)行了定性檢驗(yàn)。泡沫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)泡沫豐富、持久。Libermann-Buehard反應(yīng)，加0.5 mL醋酐，充分溶解，沿皿壁加硫酸2滴～3滴，立即顯紅色，可定性為皂苷類物質(zhì)。從HPLC圖譜中可以看出，經(jīng)純化后的苦瓜莖葉中的皂苷類物質(zhì)主要有2個(gè)組分，分別與人參皂苷Rg1和Rb1的極性接近。

4 討論

苦瓜中皂苷類物質(zhì)的提取分離有許多報(bào)道，都是以苦瓜的果實(shí)，果肉為原料，研究提取的方法、皂甙的含量和組成等。崔恒林等采用有機(jī)溶液浸提苦瓜肉中總皂苷，含量為0.052%[14]。本實(shí)驗(yàn)室2007年曾研究了苦瓜皂苷和多糖的綜合提取工藝，以微波、超聲波輔助提取，從苦瓜干粉中提取皂苷，含量為0.024%，多糖含量為3.02%[15]。以苦瓜莖葉為原料提取制備皂苷類物質(zhì)還鮮見(jiàn)報(bào)道，從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，秋季拉秧后的苦瓜莖葉中含有豐富的皂苷類物質(zhì)，顯色法測(cè)定莖葉中總皂苷平均含量達(dá)到達(dá)到了4.9%，廢棄的莖葉極具開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。

皂苷的分離純化常用大孔吸附樹(shù)脂的柱層析法。大孔吸附樹(shù)脂對(duì)化合物的吸附/解吸附能力是由樹(shù)脂的極性、比表面積、孔徑以及化合物本身的性質(zhì)等綜合因素決定的，研究中主要考察大孔吸附樹(shù)脂對(duì)分離物質(zhì)的吸附率/解吸附率。黎海彬[16]等在此方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同極性和性質(zhì)的多種大孔樹(shù)脂用于苦瓜皂甙的吸附分離、純化，結(jié)果表明AB-8型樹(shù)脂對(duì)于苦瓜中的部分皂苷具有良好的吸附分離性能[17]。在本實(shí)驗(yàn)中同樣采用AB-8型樹(shù)脂分離制備苦瓜莖中的皂苷類物質(zhì)，采用2次吸附純化后，用2倍柱床體積的80%的乙醇溶液洗脫，皂苷的純度可達(dá)到85%左右，但收得率較低，可能是由于浸提時(shí)采用的是60%的酒精溶液，極性較大皂甙在柱層析水洗脫時(shí)，溶于水中，而未回收造成的。提示在制備苦瓜莖葉總皂苷時(shí)要注意不同極性皂苷的吸附和洗脫條件的摸索。

苦瓜中含有多種皂苷成分，例如，2001年Tosbiyuki[18]等從苦瓜新鮮的果實(shí)中分離出苦瓜甙-a，-b，-c，-d，-e，-f，-g，-h等八種皂苷?？喙显碥盏纳锘钚灾饕w現(xiàn)在調(diào)節(jié)血糖、降血脂、抗氧化、抗菌等方面[19-21]。本試驗(yàn)表明，從苦瓜莖葉中可以得到大量的皂苷類物質(zhì)，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功效研究正在進(jìn)行中，將在后續(xù)報(bào)道。

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Extract and Purification Saponins from the Stem and Leaf of Momordica Charantia L.

ZHANG Yu-chan1，2,LIU Jin-fu2,*,ZHANG Ping-ping2,JIANG Ying1,PANG Hong-xun1，2
（1.College of Food science and Engineering，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang,China；2.Department of Food science，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384,China）

There were plenty of saponins in the stem and leaf of momordica charantia.Several influential factors in the extraction of saponin from momordica charantia L,including temperature,solid-liquid ratio,time,mass fraction of alcohol.This article extract the material with 60%ethanol at 70 ℃ in 3 h with solid to liquid ratio 1∶15.After extracting the 60 mesh material for twice times,the extraction of saponin got from the stem and leaf of momordica charantia was 2.92%and 6.9%,the extraction ratio was 5.9%and 13.6%,and the saponin in the part of extraction was 49.5%and 50.1%.After purifing the extraction part twice times with AB-8 Macroporous absorption resin,the purity of saponins raised to 83.4%and 86%.By HPLC,the result indicated that there was two types saponins in momordica charantia.

the stem and leaf of momordica charantia;saponins;extraction;purification

張玉嬋(1983—)，女(漢)，在讀碩士，研究方向:天然產(chǎn)物的提物與分離。

*通訊作者

2009-12-11