郭小文 朱美飛 徐勇剛 雷 澍

浙江省中醫(yī)院（杭州 310006）

膿毒癥是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術和感染后常見并發(fā)癥,其本質為不同感染性因素所致失控性炎性反應。細菌、真菌、病毒及其毒性產物等均可誘發(fā)本病。臨床流行病學資料顯示,膿毒癥是危重癥患者的主要死亡原因之一,現已成為進一步提高危重癥救治成功率的最大障礙。膿毒癥患者常伴有免疫抑制，是膿毒癥預后差的主要原因，同時膿毒癥免疫抑制與淋巴細胞凋亡加速關系密切[1]。減輕膿毒癥的淋巴細胞凋亡不但能提高免疫功能，而且能改善預后。已有多項研究證實，針刺足三里、關元穴能提高機體免疫功能，但其機制尚未完全闡明。本研究以盲腸結扎穿孔（CLP）致腹腔感染膿毒癥大鼠為模型，研究電針足三里、關元穴對胸腺細胞凋亡的影響，并進一步探討其作用機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：SD健康大白鼠(由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供），體質量200～250g，雌雄各半。（2）主要設備與儀器：G6805－A型電針治療儀由上海醫(yī)療儀器廠生產，AnnexinⅤ－PI雙染試劑盒購自羅氏公司，血管活性腸肽 (VIP）放免試劑盒由北京?？其J生物制品有限公司提供，Epics－profile型流式細胞儀由美國Coulter公司生產。

1.2 方法 （1）分組及造模：應用分段隨機分組法將大鼠分為3組(每組12只）：正常對照組、模型組、針刺組。大鼠以鹽酸氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉后，作1～2cm長的腹正中切口。游離出盲腸并用30號絲線結扎，以22G針頭于盲腸穿刺2處，并擠出小量腸內容物以保持穿刺孔開放。還納腸管，以絲線縫合關腹。術畢皮下注射生理鹽水2mL。所有實驗大鼠均在安靜環(huán)境下統(tǒng)一喂養(yǎng)。針刺組每日針刺足三里穴，進針5～7mm，關元穴進針3～5mm，通電留針30min，采用連續(xù)波，頻率3次/s，強度以針柄顫動，但能使動物不掙扎嘶叫，保持安靜為度。定位取穴參照《實驗針灸學》[2]。針刺組于術后復蘇成功后分別于即刻、12h和24h行電針治療。正常對照組與膿毒癥模型組大鼠每日相同時刻以同樣方法固定30min，但不行電針刺激。（2）標本采集及測定：所有大鼠于術后36h處死，收集標本進行凋亡檢測。光學顯微鏡和透射電鏡下觀察胸腺形態(tài)學改變。Annexin－PI雙染色法標記，網搓法分離胸腺細胞，將細胞收集到試管，PSB洗2次，離心棄上清液，懸浮沉淀的細胞，取50μL細胞懸液(含細胞數5×105～1×1010個）加入試管中，同時試管中加入1μL AnnexinVFITC試劑及5μL PI(0.25g/L）溶液，4℃下避光反應，10min后加冷緩沖液400μL，30min內上機檢測。（3）腦垂體和外周血中VIP含量：采血2mL，125kU/mL肝素抗凝。應用放射免疫分析法 (RIA）測定腦垂體和外周血中VIP含量，按試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，采用One－Way ANOVA統(tǒng)計方法。計量資料以(）表示。

2 結果

2.1 各組胸腺細胞凋亡的形態(tài)學變化 （1）光鏡觀察結果：正常對照組胸腺組織學所見基本一致，胸腺無明顯病理改變，胸腺細胞密集分布于胸腺皮質，細胞核呈圓形，深藍色著染，胞質少，凋亡小體少見；核較大而著色淺的上皮性網狀細胞散在于其間。過渡到胸腺髓質后，胸腺細胞數目明顯減少，逐漸以上皮性網狀細胞為主。CLP后36h各組大鼠胸腺皮質細胞稀疏，而髓質區(qū)細胞無明顯減少，細胞分布反而較皮質區(qū)密集。皮質區(qū)凋亡細胞增多，核染色質濃縮、固縮，可見吞噬細胞碎片和凋亡小體的巨噬細胞。（2）透射電鏡觀察結果：正常對照組胸腺皮質內可見許多淋巴細胞，表面光滑，核大胞漿少，胞內細胞器少，線粒體無腫脹，粗面內質網發(fā)達，細胞核密度高。CLP致腹腔感染各組大鼠胸腺的淋巴細胞與上皮網狀細胞均遭到不同程度的破壞。凋亡的胸腺淋巴細胞主要表現為細胞器增殖的凋亡細胞胞體變大，胞體內充滿增殖的細胞器，以線粒體和粗面內質網為主；細胞器不增殖的凋亡細胞體皺縮，細胞形態(tài)不規(guī)則，核漿比例減少，核固縮，核染色質固縮成新月形或塊狀，線粒體和粗面內質網腫脹、增多。晚期細胞核崩裂為多個小球形塊，經細胞膜出芽形成多個凋亡小體。

2.2 各組大鼠胸腺淋巴細胞凋亡率比較 見表1。與正常對照組相比，模型組和針刺組36h后大鼠胸腺細胞凋亡率均明顯升高，(P＜0.05）；與模型組相比，針刺組胸腺細胞凋亡率明顯降低(P ＜ 0.05）。

表1 各組胸腺細胞凋亡率、外周血和腦垂體中VIP含量比較 (）

表1 各組胸腺細胞凋亡率、外周血和腦垂體中VIP含量比較 (）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

組 別n 凋亡淋巴細胞比例（%）腦垂體VIP含量（ng/L）外周血VIP含量（ng/L）539.60±34.50 335.60±27.30*433.10±52.90*△△20.10±2.20 43.60±3.20*31.50±3.20*△12 12 12正常對照組模型組針刺組22.30±1.50 12.30±1.30*16.20±1.20*△△

2.3 各組外周血和腦垂體中VIP含量變化 模型組和針刺組大鼠外周血和腦垂體中VIP含量均明顯低于正常對照組 (P＜0.05）；但針刺組外周血和腦垂體中VIP含量均明顯高于模型組(P ＜ 0.05），見表 1。

3 討論

近年來隨著膿毒癥致病機制和宿主對膿毒癥反應基因學基礎研究的不斷深入，人們對膿毒癥的病理生理機制有了新的認識，已認識到機體免疫狀態(tài)紊亂在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。許多學者發(fā)現膿毒癥患者往往伴有免疫抑制，包括遲發(fā)高反應的消失，清除感染的障礙和院內感染的發(fā)生率高，目前認為這是膿毒癥治療成功率低的重要原因。近年來得益于基礎研究的進步，膿毒癥免疫抑制發(fā)生的機制正逐步闡明。目前認為膿毒癥免疫抑制與淋巴細胞凋亡加速關系密切。大量研究證實了淋巴細胞在本癥發(fā)展中發(fā)生了凋亡[3,4]。本研究中，光鏡和電鏡證實在CLP 36h后各組胸腺細胞凋亡增多，胸腺細胞凋亡率明顯升高。膿毒癥時,由于細菌及內毒素的不斷入侵,T淋巴細胞在受到外來抗原刺激后被激活,當出現異常的活化信號或非特異性的損傷時可導致淋巴細胞的凋亡。雖然淋巴細胞對外界的刺激異常敏感是細胞自身的一種保護機制,但淋巴細胞的過度凋亡會削弱抗體的產生，巨噬細胞的激活和抗原的遞呈能力,繼而直接和間接損害免疫功能,最終導致免疫抑制,減弱機體抗感染能力。膿毒癥時，大量淋巴細胞凋亡是機體重要的應激反應，這種反應使許多生理條件下應該被淘汰的細胞不致由于膿毒癥時免疫功能的紊亂而被錯誤地保留。研究發(fā)現，死亡的膿毒癥患者中，其外周血淋巴細胞Bcl－2表達明顯下降，凋亡的淋巴細胞明顯增加[5]。膿毒癥患者尸檢研究也顯示，許多參與獲得性免疫反應的炎癥細胞凋亡增加。研究發(fā)現抑制淋巴細胞異常凋亡可明顯改善膿毒癥的預后。Hotchkiss等[6]證實TAT－BH4和TAT－Bcl－xL縮氨酸能減輕膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡并改善預后。Chung等[7]報道Fas－L缺陷膿毒癥模型鼠黏膜B淋巴細胞凋亡減少且生存率提高；Schwulst等[8]發(fā)現使用競爭性CD40受體單克隆抗體能減少淋巴細胞凋亡，進而明顯改善膿毒癥預后。因此，膿毒癥時糾正淋巴細胞異常凋亡已成為治療膿毒癥的新方向。

近年來一些臨床和實驗研究發(fā)現針灸對免疫功能有增強作用。雖然研究結果存在差異，但結果均證實，針灸對免疫系統(tǒng)具有雙向良性調節(jié)作用，包括對白細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等細胞免疫均有促進和調節(jié)作用。陳永等[9]發(fā)現針灸足三里、關元等強壯要穴可以顯著提高機體的免疫功能。謝延等[10]發(fā)現艾灸關元、足三里可在一定程度上改善衰老機體的免疫衰退或紊亂情況，增強免疫器官功能；提高淋巴細胞轉化率,從多個途徑增強或改善機體免疫功能。袁民等[11]發(fā)現艾灸中脘、神闕、關元穴能提高荷瘤小鼠的免疫力，提高CD3、CD4、CD4/CD8比率、NK細胞、LAK等細胞殺傷活性。高洪泉等[12]發(fā)現針刺足三里、關元能提高單核巨噬系統(tǒng)的吞噬功能，進而達到增強免疫功能的效果。

本研究通過電鏡和光鏡胸腺病理組織學和AnnexinV/PI雙染色法檢測胸腺細胞凋亡率證實電針足三里、關元穴能減輕膿毒癥大鼠胸腺細胞的凋亡。研究還發(fā)現其機制可能與電針足三里、關元穴使膿毒癥大鼠腦垂體和外周血中VIP的合成和釋放增多有關。本研究為臨床進一步應用針灸調節(jié)膿毒癥患者的免疫功能提供了新的手段和實驗依據。

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