劉小鵬 孟曉軍 郭楊彬

糖尿病大血管病變是糖尿病常見的嚴重慢性并發(fā)癥之一，血管內(nèi)皮細胞的功能紊亂和損傷是其中一個重要的因素。c-fos是細胞內(nèi)的一種癌基因，其表達產(chǎn)物Fos和Jun能形成異源二聚體，即有活性的轉(zhuǎn)錄因子AP-1，調(diào)節(jié)基因的表達和蛋白質(zhì)的合成，從而參與細胞增殖、凋亡等過程。國內(nèi)外研究表明糖尿病時c-fos原癌基因參與了糖尿病大血管病變的病理生理過程，但c-fos原癌基因在血管內(nèi)皮細胞表達情況極少見報道。本實驗的主要目的是觀察在高糖培養(yǎng)條件下，人臍靜脈內(nèi)皮細胞中c-fos mRNA和蛋白的表達變化情況，為糖尿病的臨床和基礎(chǔ)研究提供有益的探索。

1 材料

新生兒臍帶:來自中山大學第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦，無菌操作取下臍帶，置PBS溶液中浸泡，4℃冰箱保存，于4 h之內(nèi)使用;DMEM培養(yǎng)基(低糖型)、胎牛血清(FBS):Gibco公司產(chǎn)品;c-fos抗體:Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品，使用濃度為1:50;S-P試劑盒(含二抗羊抗兔):深圳晶美公司產(chǎn)品;AMV cDNA第一鏈合成試劑盒:BBI公司產(chǎn)品;引物:上海生工生物工程公司合成;PCR擴增試劑盒:上海生工生物工程公司產(chǎn)品;Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體:ZYMED公司產(chǎn)品，使用濃度為1:100。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 參照文獻［1］。

2.2 內(nèi)皮細胞的鑒定 ①倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特點。②Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學檢測。

2.3 實驗分組及處理 將生長良好的第2代或第3代細胞用于實驗。實驗分組如下:①對照組(Glu 5.5 mmol/L);②高糖組1(Glu 11 mmol/L);③高糖組2(Glu 22 mmol/L);④高糖組3(Glu 44 mmol/L);⑤甘露醇組(22 mmol/L)。并選取22 mmol/L Glu 分別作用0 h、1/2 h、1 h、2 h 為不同時間點。

2.4 總RNA的提取、cDNA的合成、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)按照試劑盒說明書進行，引物序列如下:GAPDH［2］:上游引物:5 ’-GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT-3’，下游引物:5 ’-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3’，目的片段長度:420 bp;c-fos［2］:上游引物:5 ’-AGA ATC CGA AGG GAA AGG AA-3’，下游引物:5 ’-CTT CTC CTT CAG CAG GTT GG-3’，目的片段長度:150 bp。循環(huán)參數(shù)如下:GAPDH:94℃ 5 min 1 cycle;94℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 60 s，30 cycles;72℃ 10 min 1 cycle。c-fos:94℃ 5 min 1 cycle;94℃ 40 s、54℃ 40 s、72℃ 60 s，30 cycles;72℃ 10 min 1 cycle。

2.5 免疫細胞化學 按照試劑盒說明書進行(一抗為Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體、c-fos，陰性對照用0.01M PBS)。

3 結(jié)果

3.1 HUVECs的鑒定 臍靜脈內(nèi)皮細胞融合后在倒置相差顯微鏡下觀察呈單層鋪路卵石樣免疫細胞化學見Ⅷ因子抗原胞漿顆粒狀表達，證實為95%以上的細胞為內(nèi)皮細胞。

3.2 高糖對c-fos基因表達的影響

3.2.1 總RNA的鑒定 總RNA提取產(chǎn)物在紫外分光光度計下測A260/A280的OD比值在1.8～2.0之間。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下可見2條清晰的條帶，分別28 s、18 s，且28 s/18 s＞1.5，示 RNA 無明顯降解。

3.2.2 c-fos在HUVECs中的轉(zhuǎn)錄 PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于凝膠圖像分析系統(tǒng)攝像，進行灰度分析，結(jié)果見下圖1、2，c-fos和GAPDH擴增片段分別為150 bp和420 bp，與理論設(shè)計相符。

圖1 不同處理因素對c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

圖2 22 mmol/L Glu作用不同時間c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄

3.2.3 葡萄糖濃度對c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 選取5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、44 mmol/L 濃度組以觀察葡萄糖對c-fos基因轉(zhuǎn)錄的濃度影響。從圖1可以看出，各組GAPDH mRNA水平相差不大，但c-fos mRNA的量從5.5～22 mmol/L隨葡萄糖濃度增加而逐漸增高(P＜0.01)，22 mmol/L組達最高峰。其c-fos/GAPDH mRNA比值見表1。

表1 葡萄糖濃度對c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響(n=3)

3.2.4 葡萄糖作用時間對c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 根據(jù)量效結(jié)果，選取22 mmol/L為作用濃度，觀察葡萄糖對c-fos基因表達的時間影響。從圖2可以看出，c-fos mRNA水平逐步增高，2 h組中表達降低(P＜0.01)。c-fos的灰度比值見表2。

表2 葡萄糖作用時間對c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄的影響(n=3)

3.2.5 高糖對c-fos蛋白表達的影響 HUVECs經(jīng)過22 mmol/L高糖處理2 h免疫細胞化學檢測為陽性(見下圖3)，而未經(jīng)高糖處理為陰性(見下圖4)。

圖3 22 mmol/L Glu作用2 h c-fos蛋白表達(S-P法40×)

圖4 正常Glu c-fos蛋白表達(S-P法40×)

3.2.6 甘露醇對c-fos轉(zhuǎn)錄的影響 從圖1可以看出，甘露醇組與相應(yīng)正常葡萄糖組比較，c-fos mRNA水平無明顯升高(P＞0.05)。相關(guān)灰度比值數(shù)據(jù)從略。

4 討論

c-fos屬于即刻早基因，正常情況下在大多數(shù)細胞都有極低水平的表達，參與細胞的正常生長、增殖、分化、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信息傳遞等生理過程。在受到多種傷害性時，能迅速表達，參與細胞的凋亡、修復等過程。但一般來說，其表達快速、短暫;mRNA半衰期短，不穩(wěn)定;并且通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)與Jun蛋白形成異源性二聚體復合物，即具有活性的轉(zhuǎn)錄因子復合物AP-1，AP-1通過順式作用激活相關(guān)的基因，從而調(diào)節(jié)基因的表達與蛋白質(zhì)的合成［3］。

本研究發(fā)現(xiàn)高糖(22 mmol/L)作用下，HUVECs中c-fos的mRNA水平在1 h左右達到高峰，隨后下降。隨葡萄糖濃度增高c-fos mRNA表達量也增加，葡萄糖濃度至22 mmol/L達最高峰，44 mmol/L時下降，其原因可能與葡萄糖濃度過高毒性作用增加抑制細胞活性等有關(guān)。c-fos蛋白表達也隨時間延長而逐漸增高，至2 h達最高峰，隨后下降，與其他研究基本一致［4］。甘露醇組c-fos mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達無明顯增高。

高糖引起HUVECs c-fos轉(zhuǎn)錄和蛋白合成增加的原因未明，目前認為可能與PKC通路激活有關(guān)，筆者前期的工作也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。AP-1是PKC的經(jīng)典核內(nèi)靶分子。高糖激活PKC通路的機制如下:①從頭合成(de novo)途徑:高糖經(jīng)酵解產(chǎn)生中間產(chǎn)物，逐步?；铣蒁AG，此為高糖激活PKC的主要途徑;②磷脂酶D水解磷脂酰膽堿生成DAG途徑;③山梨醇通路激活、蛋白質(zhì)非酶糖化、氧化應(yīng)激均可使DAG生成增加而激活 PKC［5］。

筆者發(fā)現(xiàn)高糖時HUVECs中PKC通路激活一方面可以引起VEGF的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成增加［6］，因此可能導致血管內(nèi)皮細胞增生，新生血管形成;另一方面引起c-fos轉(zhuǎn)錄和蛋白合成增加，從而導致內(nèi)皮細胞的凋亡［7］。具體哪方面因素何時占主導地位，可能是一個值得研究的課題。在此，不妨可以大膽假設(shè)一下:在糖尿病的早期，以第一條途徑為主，此時表現(xiàn)出來的是內(nèi)皮細胞增生，血管內(nèi)皮層較為完整;至中晚期，則第二條途徑占主導地位，因此出現(xiàn)內(nèi)皮細胞的凋亡，血管內(nèi)皮層的破壞，進而出現(xiàn)糖尿病大血管的典型病變。

［1］王立巖，冬曉紅，宮桂蘭，等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)觀察.白求恩醫(yī)科大學學報，2000，26(1):26-28.

［2］Shinichi Sakurai，Shahabuddin Alam，Glorivee Pagan-Mercado，et al.Retinal Capillary Pericyte Proliferation and c-fos mRNA Induction by Prostaglandin D2 through the cAMP Response Element.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43:2774-2781.

［3］Liang F，Seyrantepe V，Landry K，et al.Monocyte differentiation upregulates the expression of the lysosomal sialidase，neul，and triggers its targeting to the plasma membrane via major histocompati-bility complex classⅡ-positive compartment.J Biol Chem，2006，281(37):27526-27530.

［4］宋冰，魏執(zhí)真，呂仁和.中藥糖心寧口服液對血管平滑肌細胞原癌基因c-myc和 c-fos表達的影響.中醫(yī)雜志，2004，45(4):292-294.

［5］Scivittaro V，Ganz MB，Weiss MF.AGEs induce oxidative stress and activate protein kinase C-βⅡ in neonatal mesangial cells.Am J Physiol，2000，278:F676-683.

［6］劉小鵬，羅春英，曹仁賢，等.高糖作用下HUVECs中VEGF基因表達與PKC通路的關(guān)系研究.中國動脈硬化雜志，2006，14(1):17-20.

［7］羅春英，劉小鵬，文格波，等.p38絲裂素活化蛋白激酶在高糖損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的作用.中國動脈硬化雜志，2006，14(10):853-856.