羅閎丹，楊 芬，施 旻，謝小梅

(江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330004)

侵襲性肺曲霉病(invasivepulmonary aspergillosis，IPA)是免疫力低下患者煙曲霉菌感染的最常見(jiàn)類(lèi)型，其死亡率高達(dá)80% ～90%，預(yù)后很差。目前臨床上用于治療煙曲霉感染的藥物主要是化學(xué)合成類(lèi)藥物，如兩性霉素B及其衍生物、唑類(lèi)化合物、烯丙胺類(lèi)等，它們對(duì)IPA的作用主要是通過(guò)直接抗煙曲霉菌而起效，這些藥物的毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性且價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用受到限制，且單純的抗真菌藥物常難以奏效，因此調(diào)節(jié)、恢復(fù)或重建機(jī)體的免疫功能可能是根本措施。

研究表明，傳統(tǒng)的補(bǔ)益方劑如十全大補(bǔ)丸、四君子湯及當(dāng)歸補(bǔ)血湯等，在治療深部真菌感染特別是白色念珠菌深部感染有一定的效果，但對(duì)煙曲霉深部感染的實(shí)驗(yàn)治療研究較少。四君子湯作為傳統(tǒng)的補(bǔ)益方劑，能明顯改善機(jī)體免疫功能，臨床應(yīng)用廣泛，迄今未見(jiàn)其對(duì)侵襲性肺煙曲霉病作用的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)建立IPA小鼠模型，灌胃四君子湯，觀察其對(duì)IPA小鼠的影響，為中藥補(bǔ)益方劑用于治療難治性IPA積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

四君子湯購(gòu)自江西省中醫(yī)院，按傳統(tǒng)組方配制:黨參9g，白術(shù)9g，茯苓9g，炙甘草6g。實(shí)驗(yàn)前制成50%、100%、200%水煎劑備用。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)昆明系小鼠，5周齡，體重為22g±2g，雄性，由江西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

酮康唑(TCZ)由西安揚(yáng)森制藥有限公司生產(chǎn)，口服片劑(060421199);環(huán)磷酰胺(cy)由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)(06060521)。

煙曲霉菌:購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌中心(南京)(為臨床分離菌株，編號(hào)為3910);蔡氏培養(yǎng)基:參考文獻(xiàn)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將小鼠隨機(jī)分為7組:A組(n=5):正常組(正常健康小鼠);B組(n=5):免疫抑制組(僅注射環(huán)磷酰胺小鼠);C組(n=15):正常+接種煙曲霉組(不注射環(huán)磷酰胺但接種煙曲霉小鼠);D組(n=15):模型組(免疫抑制并感染煙曲霉菌小鼠);E組(n=15):低劑量四君子湯治療組(給予50%四君子湯灌胃的IPA小鼠);F組(n=15):中劑量四君子湯治療組 (給予100%四君子湯灌胃的IPA小鼠);G組(n=15):高劑量四君子湯治療組(給予200%四君子湯灌胃IPA小鼠);H組(n=15):陽(yáng)性對(duì)照組(給予酮康唑灌胃的IPA小鼠)。

1.2.2 小鼠IPA模型建立

誘導(dǎo)免疫抑制:各組小鼠腹腔注射cy200mg·kg·d，A、C組腹腔注射相同劑量生理鹽水，連續(xù)注射2d，測(cè)定小鼠淋巴細(xì)胞百分率、巨噬細(xì)胞數(shù)、脾細(xì)胞數(shù)及胸腺和脾臟的重量。

建立IPA小鼠模型:將煙曲霉菌活化2次后收集菌液，煙曲霉孢子懸液制備成孢子濃度為107個(gè)/ml。乙醚麻醉小鼠，加樣槍吸取孢子懸液50μl滴入鼻孔，使之被動(dòng)吸入肺部。

1.2.3 給藥方法 四君子湯治療組從煙曲霉菌吸入當(dāng)天開(kāi)始給藥，每日灌胃1次，每日O.5ml，連續(xù)給藥1周。另設(shè)酮康唑陽(yáng)性對(duì)照組:酮康唑(TCZ)按小鼠體表面積折算其用量，劑量為30mg·kg·d，其余各組灌胃同等劑量生理鹽水。

1.2.4 小鼠各臟器煙曲霉培養(yǎng) 各組小鼠灌胃7d后，于第8天處死，無(wú)菌取肺、肝、脾、腎組織碾磨，在蔡氏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d～6d，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.2.5 各臟器的病理切片觀察 于第8天無(wú)菌取小鼠肺、肝、脾、腎用福爾馬林固定做石蠟切片，分別用HE和PAS常規(guī)染色。鏡下觀察各組織的病理改變情況。

1.2.6 生存保護(hù)實(shí)驗(yàn) 另取清潔級(jí)昆明系小鼠90只，隨機(jī)分成6組，即正常組+煙曲霉接種組、模型組、低劑量四君子湯治療組、中劑量四君子湯治療組、高劑量四君子湯治療組和陽(yáng)性對(duì)照組。從接種煙曲霉開(kāi)始連續(xù)4周觀察小鼠生存情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制

表1顯示，小鼠腹腔連續(xù)2d注射環(huán)磷酰胺200mg·kg·d，與正常組小鼠比較，脾臟和胸腺重量下降，脾細(xì)胞數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)及外周血淋巴細(xì)胞百分比顯著降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，說(shuō)明小鼠連續(xù)2d腹腔注射環(huán)磷酰胺200mg·kg·d能有效誘導(dǎo)免疫抑制。

2.2 小鼠各組織煙曲霉培養(yǎng)情況

表2、圖1～圖5顯示，正常組+煙曲霉菌接種組與IPA模型組的肺、肝組織菌落數(shù)差異有顯著性意義(P<0.05);各治療組與IPA模型組的肺、肝組織菌落數(shù)差異有顯著性意義(P<0.05)，且煙曲霉色素明顯減弱;四君子湯低劑量組分別與中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組比較，肺、肝組織的煙曲霉菌落數(shù)差異有顯著性意義(P<0.05);中、高劑量組分別與陽(yáng)性對(duì)照組比較，肺、肝組織的煙曲霉菌落數(shù)差異無(wú)顯著性意義(P>0.05);脾、腎組織煙曲霉培養(yǎng)的菌落數(shù)都較少，各組之間差異無(wú)顯著性意義。

表1 環(huán)磷酰胺給藥組與正常對(duì)照組免疫指標(biāo)的比較(±s，n=5)

表1 環(huán)磷酰胺給藥組與正常對(duì)照組免疫指標(biāo)的比較(±s，n=5)

注:與正常組比較:★P<0.05

組 別 劑量(mg·kg －1·d －1)時(shí)間(d)脾臟重量(g)胸腺重量(g)淋巴細(xì)胞百分比(%)脾細(xì)胞數(shù)(106)腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)(106)正 常 組 0 2 0.1044±0.0431 0.0484±0.0211 81.74±7.63354.83±7.144 7.221±1.544 CY 組 200 2 0.0378±0.0674★ 0.0173±0.0073★ 37.54±6.674★ 5.883±0.996★ 0.754±0.3852★

表2 各組小鼠肺、肝、脾、腎組織煙曲霉菌落數(shù)比較(±s)(單位:個(gè)/ml)

表2 各組小鼠肺、肝、脾、腎組織煙曲霉菌落數(shù)比較(±s)(單位:個(gè)/ml)

注:與IPA模型組比較:★P<0.05，☆P>0.05;與四君子湯低劑量組比較:▼P<0.05，▽P>0.05;與陽(yáng)性對(duì)照組比較:◇P>0.05

組別劑量 菌落數(shù)肺肝脾腎正常+煙曲霉菌接種組 —IPA模型組 —50%水煎劑 0.5ml/d四君子湯治療組 100%水煎劑 0.5ml/d 200%水煎劑 0.5ml/d陽(yáng)性對(duì)照組(酮康唑)9.0± 0.41★ 3.0±0.55★ 5.0±0.55☆ 6.5±0.80☆30mg/kg/d 102.0±14.06 56.0±8.64 13.0±1.51 9.0±1.12 47.0± 3.91★ 21.0±2.49★ 6.5±0.83☆ 8.0±0.54☆16.0± 2.58★▼◇ 10.0±1.47★▼◇ 10.5±1.16☆▼◇ 6.5±0.80☆▼◇20.5± 2.60★▼◇ 12.0±1.88★▼◇ 8.0±1.51☆▼◇ 4.5±0.69☆▼◇24.5± 2.42★▼ 17.0±1.34★▼ 9.0±0.69☆▼ 9.0±1.24☆▼

2.3 各臟器的組織病理變化情況

圖6～圖9顯示，鏡下見(jiàn)IPA模型組的肺組織有大量菌絲團(tuán)，伴有壞死及大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)部分氣管上皮細(xì)胞壞死脫落;肝組織內(nèi)見(jiàn)肝竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞水腫，部分細(xì)胞脂肪變性;腎組織血管充血，部分腎小球囊腔消失。低濃度四君子湯組肺組織見(jiàn)少量菌絲，間質(zhì)明顯增生，氣管周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)明顯，有小灶性出血;肝細(xì)胞水腫明顯，肝內(nèi)可見(jiàn)多處灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并有巨噬細(xì)胞增生，腎臟未見(jiàn)明顯病變。中濃度和高濃度四君子湯組肺組織未見(jiàn)菌絲，肝細(xì)胞輕度水腫脂肪變性，腎臟除有輕度充血外基本正常。

圖1 ～圖5 各組肺組織煙曲霉培養(yǎng)情況

圖6 ～圖9 各組肺組織病理變化

2.4 小鼠生存實(shí)驗(yàn)

表3顯示，低劑量、中劑量、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的存活率均高于IPA模型組，其中中劑量組小鼠的存活率和生存質(zhì)量明顯高于IPA模型組，且高于低劑量、高劑量和陽(yáng)性對(duì)照組。

表3 各組小鼠生存率比較

3 討論

侵襲性肺曲霉病常發(fā)生于有明顯免疫缺陷的患者中，特別在器官移植、中性粒細(xì)胞缺乏、接受免疫抑制劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇治療的患者中尤為常見(jiàn)，正常人群不易感染煙曲霉。中醫(yī)理論認(rèn)為，“正氣存內(nèi)，邪不可干”。所謂正氣，一般指正常的免疫功能，正氣虛則免疫功能低。正氣強(qiáng)弱是疾病發(fā)生與否的根本原因，并在疾病的發(fā)展變化及轉(zhuǎn)歸中起主導(dǎo)作用［5］。當(dāng)機(jī)體正氣不足時(shí)，通過(guò)扶正以提高和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，達(dá)到排除和抑制病邪的目的。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常小鼠接種煙曲霉組4周后的存活率為100%，IPA模型組4周后的存活率僅為26.7%，中劑量四君子湯治療組4周后的存活率為60%，提示提高機(jī)體的免疫力對(duì)預(yù)防和治療侵襲性肺曲霉病有極其重要的意義。

四君子湯原出于宋·《太平惠民和劑局方》，方藥組成有黨參、炙甘草、茯苓、白術(shù)4味藥物。根據(jù)“脾居中州”、“脾虛易生濕”、“濕重易傷脾”的中醫(yī)理論組方遺藥，用補(bǔ)益中氣的藥物治療脾虛，佐以祛濕之品以助健脾之功，諸藥合用，共奏健脾益氣之功。中醫(yī)理論認(rèn)為，脾為后天之本，“脾旺不受邪”，四君子湯對(duì)特異性和非特異性免疫功能的增強(qiáng)作用是其補(bǔ)脾益氣功效的藥理基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予IPA模型小鼠低、中、高不同劑量的四君子湯，發(fā)現(xiàn)其肺組織的病理結(jié)果均有不同程度的改善，其中以中劑量組最佳;各組織的煙曲霉培養(yǎng)結(jié)果也顯示，給予四君子湯組的菌落數(shù)明顯少于IPA模型組且煙曲霉的色素明顯減弱;同時(shí)生存實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，中劑量四君子湯治療組能明顯提高IPA模型小鼠的生存時(shí)間，改善生存質(zhì)量。提示四君子湯對(duì)IPA模型小鼠有一定的治療作用，其作用機(jī)制研究是我們下一步要做的工作，特別是從免疫學(xué)方面通過(guò)細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)做更深入的研究探討，為中藥補(bǔ)益方劑治療難治性IPA奠定了一定的理論基礎(chǔ)。