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        牛肝菌中的尼古丁成因研究報(bào)告

        2010-11-28 01:39:08彭云霞馬曉剛李云飛趙永昌車泉劉自強(qiáng)
        食藥用菌 2010年1期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        彭云霞 馬曉剛 李云飛 熊 清 趙永昌 車泉 劉自強(qiáng)

        (1.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心,昆明 650028;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,昆明 650054;3.云南省牛肝菌協(xié)會(huì),昆明 650032;4.中國(guó)食品土畜進(jìn)出口商會(huì)食用菌分會(huì),北京 100062)

        1 研究方法及樣本

        1.1 檢測(cè)方法 本項(xiàng)目組所采用的檢測(cè)方法是中國(guó)正式公布的由云南CIQ實(shí)驗(yàn)室同EUROFONS蘇州實(shí)驗(yàn)室共同起草的進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2397-2009《進(jìn)出口食品中尼古丁檢測(cè)方法》,同時(shí)近期云南CIQ實(shí)驗(yàn)室還參加了歐盟基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室CRL組織的國(guó)際實(shí)驗(yàn)室間能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果滿意。2009年11月4~5日在德國(guó)漢堡由歐盟ESA協(xié)會(huì)主辦的中歐尼古丁成因研究會(huì)上確認(rèn):EUROFINS方法為尼古丁篩選檢測(cè)方法,云南CIQ方法為確證方法。

        1.2 樣本采集 各類牛肝菌樣本700份,其中鮮樣100份,速凍鮮樣73份,鹽漬加工樣品59份,干片468份;其他食用菌干片樣本96份。對(duì)云南主產(chǎn)區(qū)及四川、東北的食用菌生長(zhǎng)周邊環(huán)境樣本55份進(jìn)行尼古丁含量的檢測(cè),其中根系土壤樣品30份,水樣品10份,大氣樣品15份。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的人工菌絲體4種,分別是:本研究在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工培育的羊肚菌 (Morchella esculenta)、暗褐色網(wǎng)柄牛肝菌 (Phlebopus portentosus)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、青霉菌 (Penicillum sp.)。

        2.2 樣本來(lái)源 云南食用菌主產(chǎn)區(qū)的樣本由項(xiàng)目組到產(chǎn)地直接采集后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行加工,其采集加工過(guò)程經(jīng)嚴(yán)格控制,保證樣本不受外界環(huán)境的污染;歐洲區(qū)的牛肝菌干片樣本是在歐盟市場(chǎng)上購(gòu)買;中國(guó)其他產(chǎn)區(qū)的實(shí)驗(yàn)樣本由云南省牛肝菌協(xié)會(huì)會(huì)員在當(dāng)?shù)厥召?gòu)后提供;大氣樣本委托云南省楚雄、思茅、麗江環(huán)境監(jiān)測(cè)站對(duì)當(dāng)?shù)卮髿猸h(huán)境按相關(guān)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行采集所得。

        2.3 菌絲體培養(yǎng)方法 真菌菌絲體由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供,其菌絲體培養(yǎng)條件:試驗(yàn)菌株在YPDA(0.2%酵母膏,0.2%蛋白胨,2%葡萄糖,1.2%瓊脂粉)斜面上于25℃下培養(yǎng)7~8天,培養(yǎng)的菌絲接入YPD液體培養(yǎng)基 (500 mL的三角瓶裝入200 mL的培養(yǎng)基),接種后搖床振蕩培養(yǎng) (25℃,150 r/min)10天,每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)好后采用離心收集法收集菌絲體,8 000 r/min離心20 min菌絲體培養(yǎng)液,棄上清收集沉淀即為培養(yǎng)所需的菌絲體,于40℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。同時(shí)使用不接入菌絲的培養(yǎng)基同上述操作條件同步培養(yǎng)作空白對(duì)照試驗(yàn)。

        為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)論的科學(xué)準(zhǔn)確,本項(xiàng)目研究組專門送9份比對(duì)樣本到EUROFINS蘇州實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè),同期收集了由中國(guó)出口商送至德國(guó)第三方實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所得結(jié)果的數(shù)據(jù),對(duì)其進(jìn)行分析研究。

        2 試驗(yàn)結(jié)果

        2.1 項(xiàng)目研究組的檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù) 具體數(shù)據(jù)詳見表1~表7。

        表1 人工培育的菌絲體中的尼古丁含量

        表2 云南產(chǎn)區(qū)鮮牛肝菌子實(shí)體樣本的尼古丁含量

        表3 云南產(chǎn)區(qū)牛肝菌干片中的尼古丁含量

        表4 云南產(chǎn)區(qū)速凍及鹽漬牛肝菌中的尼古丁含量

        表5 其他產(chǎn)區(qū)牛肝菌干片中的尼古丁含量

        表6 其他食用菌的尼古丁含量

        表7 歐洲產(chǎn)區(qū)不同等級(jí)牛肝菌干片的檢測(cè)結(jié)果

        2.2 其他實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 EUROFINS蘇州實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同等級(jí)地區(qū)牛肝菌干片的尼古丁含量檢測(cè)結(jié)果見表8;另對(duì)產(chǎn)地為云南祥云的A級(jí)牛肝菌干片子實(shí)體不同部分的檢測(cè)結(jié)果,菌蓋的尼古丁含量為3 470μg/kg,菌柄為968μg/kg。

        不同加工方式的牛肝菌中尼古丁的含量有差異。據(jù)來(lái)自云南20個(gè)非水洗牛肝菌干片樣本和20個(gè)水洗牛肝菌干片的檢測(cè)結(jié)果,其尼古丁平均含量分別為1 278μg/kg和678μg/kg,其含量水平各為210~1 300μg/kg和 170~3 540 μg/kg。這兩組數(shù)據(jù)由出口商送往德國(guó)第三方實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)后所得。意大利對(duì)于牛肝菌尼古丁含量分析結(jié)果列于表9。

        表8 不同等級(jí)不同地區(qū)牛肝菌干片的檢測(cè)結(jié)果

        表9 意大利對(duì)干牛肝菌尼古丁含量的分析結(jié)果

        3 食用菌含尼古丁的成因分析

        從上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出,尼古丁廣泛存在于不同國(guó)家、不同地區(qū)、不同加工方式、不同種類的野生及人工種植的食用菌中。盡管本研究的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證因時(shí)間關(guān)系還只能作為間接證據(jù),但足以證明食用菌中的尼古丁是內(nèi)源產(chǎn)生的。

        3.1 尼古丁外源性污染的排查 尼古丁可能的污染源包括含煙堿類農(nóng)藥的施用,加工中與煙草的接觸污染,以及生長(zhǎng)環(huán)境中大氣、水、土的污染。

        (1)輸歐牛肝菌的生長(zhǎng)環(huán)境中含煙堿類農(nóng)藥的施用及污染的排查。牛肝菌是野生產(chǎn)品,生長(zhǎng)在海拔1 400米以上的廣大山林中,沒有必要也不可能更做不到對(duì)其施用農(nóng)藥;而中國(guó)批準(zhǔn)使用的含尼古丁的農(nóng)藥共5種,主要是用在人工種植的柑橘、蘋果、茶、小麥、菜豆、黃瓜及十字花科植物中。這些作物主要種植在農(nóng)田或坡地的無(wú)林地上,而牛肝菌生長(zhǎng)的區(qū)域是有林地,兩者的種植區(qū)域沒有交叉,不會(huì)因?qū)ζ渌魑锸┯棉r(nóng)藥而對(duì)牛肝菌造成污染;在牛肝菌的實(shí)際生長(zhǎng)區(qū)域中,上述作物的種植區(qū)主要在居民集中的平地或坡地上,而牛肝菌則是生長(zhǎng)在高于這些區(qū)域的山地上,由于水從高處往低處流,不會(huì)將低地處施用的農(nóng)藥帶到高地上;大氣循環(huán)是在全球很大的一個(gè)范圍內(nèi)進(jìn)行的,局部區(qū)域的農(nóng)藥施用并不總會(huì)因大氣循環(huán)而對(duì)本區(qū)域的植物造成污染,對(duì)大氣樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)也說(shuō)明云南野生菌主產(chǎn)區(qū)的大氣并不存在尼古丁的污染。

        (2)輸歐牛肝菌的生長(zhǎng)和加工與煙草的接觸污染情況的排查。第一,牛肝菌必須生長(zhǎng)在較高海拔的林地上,保持比平地或坡地低的溫度及較少的陽(yáng)光直射,而烤煙必須生長(zhǎng)在平地或坡地的無(wú)林地上,陽(yáng)光的照射能促進(jìn)其有機(jī)物質(zhì)的合成,兩者的最適生長(zhǎng)溫度、濕度及光照條件是不一樣的,因而其生長(zhǎng)區(qū)域相距甚遠(yuǎn),更不可能交叉,不存在所謂根系延伸污染的問(wèn)題;且牛肝菌的生長(zhǎng)區(qū)域海拔高于烤煙種植區(qū)域,不存在水流帶來(lái)的污染。所以,在生長(zhǎng)區(qū)過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)因與煙草接觸而帶來(lái)的污染。第二,目前云南出口牛肝菌的生產(chǎn)加工企業(yè)是嚴(yán)格按食品加工衛(wèi)生控制規(guī)范要求進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管的,在生產(chǎn)及加工區(qū)內(nèi)嚴(yán)禁吸煙,即使有個(gè)別企業(yè)管理失范,在生產(chǎn)過(guò)程中偶有個(gè)別人員吸煙,牛肝菌中的尼古丁也只會(huì)出現(xiàn)在個(gè)別的產(chǎn)品中,而不會(huì)被歐方普遍檢出。云南牛肝菌干片的生產(chǎn)方式采用的是傳統(tǒng)的熱風(fēng)干燥,這種干燥方式與烤煙房并無(wú)任何關(guān)系。香味是烤煙最重要的品質(zhì)指標(biāo)之一,對(duì)烤煙種植者來(lái)說(shuō),烤煙的經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于牛肝菌,一旦牛肝菌自身濃郁的芳香氣味進(jìn)入烤煙房?jī)?nèi),就會(huì)對(duì)烤煙氣味造成不良的影響,降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此,云南省煙草行業(yè)在全省范圍內(nèi)實(shí)施了非常嚴(yán)格的煙草烤房的標(biāo)準(zhǔn)化管理,絕不會(huì)允許牛肝菌與烤煙在同一區(qū)域內(nèi)干燥加工的情況發(fā)生。

        (3)牛肝菌生長(zhǎng)環(huán)境 (大氣、水、土)的污染情況排查。檢測(cè)結(jié)果顯示,云南野生菌主產(chǎn)區(qū)的大氣、土壤、水等環(huán)境樣本中的尼古丁含量極低,只是PPB級(jí) (1×10-9),而中國(guó)四川、東北產(chǎn)區(qū)土壤中尼古丁含量同云南食用菌主產(chǎn)區(qū)含量相當(dāng),云南食用菌的生長(zhǎng)環(huán)境并不存在尼古丁的污染。同時(shí),包括歐盟國(guó)家在內(nèi)的各類實(shí)驗(yàn)室在全球范圍內(nèi)產(chǎn)區(qū)的各類野生食用菌中都檢出了尼古丁,且其平均含量水平不存在顯著差異,證實(shí)了各類野生食用菌中尼古丁的存在同環(huán)境因素污染無(wú)關(guān)。如果是人為污染,那么只可能是偶然性地在少數(shù)樣本中檢出尼古丁,而不可能在中歐各個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)所有受檢的食用菌樣本中都檢出。

        3.2 尼古丁是食用菌產(chǎn)品內(nèi)源性次生代謝產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)論證

        (1)鮮牛肝菌子實(shí)體尼古丁的檢測(cè)情況。100份鮮牛肝菌子實(shí)體試驗(yàn)樣本均由研究人員親自到產(chǎn)區(qū)采集,無(wú)一例外地均檢出了尼古丁,鮮品中尼古丁的含量在35~65μg/kg。除牛肝菌外,擔(dān)子菌門中其他科屬食用菌中也均可檢出尼古丁。被檢出尼古丁的食用菌包括:野生菌類中的美味牛肝菌,羊肚菌,松茸,塊菌,黑木耳,榛蘑,虎掌菌,雞油菌,青頭菌,冬蟲夏草等;人工栽培菌中的香菇、平菇、木耳等。不過(guò),不同種屬、不同菌齡間的尼古丁含量水平有所差異。

        (2)對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工培養(yǎng)的4種菌絲體的尼古丁檢測(cè)情況。結(jié)果均檢出了尼古丁。除在擔(dān)子菌門的多種食用菌子實(shí)體中及人工菌絲體檢出尼古丁外,也在黑曲霉和青霉菌等真菌的菌絲體中檢出。證實(shí)了尼古丁是真菌類物種生長(zhǎng)過(guò)程中普遍產(chǎn)生、存在的一種次生代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)生機(jī)理有待于深入地研究。

        (3)來(lái)自世界各產(chǎn)區(qū)的牛肝菌干片及其他食用菌產(chǎn)品中均可以檢出尼古丁。在2009年11月4~5日“中歐牛肝菌中尼古丁成因研討會(huì)”和2009年12月3日CIAA向歐盟消保司的陳述會(huì)上,除本項(xiàng)目組外,法國(guó)、意大利、德國(guó)等國(guó)的研究機(jī)構(gòu)交流的檢測(cè)數(shù)據(jù)也毫無(wú)爭(zhēng)議地證實(shí)了這一事實(shí)的存在。各國(guó)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)充分證實(shí)含尼古丁的食用菌包括了野生食用菌和人工種植食用菌,兩者的生長(zhǎng)環(huán)境控制和生長(zhǎng)方式完全不同。尼古丁廣泛存在的事實(shí)充分說(shuō)明食用菌中的尼古丁是一種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。

        4 影響各類牛肝菌中尼古丁含量水平主要因素的實(shí)驗(yàn)

        各產(chǎn)區(qū)的牛肝菌干片中均可檢出尼古丁,歐洲4個(gè)國(guó)家26份樣本尼古丁含量為306~1 645μg/kg;云南產(chǎn)區(qū)尼古丁的平均含量為986μg/kg(398份樣本);中國(guó)其他產(chǎn)區(qū)50份樣本尼古丁的平均含量為822μg/kg。同一產(chǎn)區(qū)不同等級(jí)的牛肝菌尼古丁含量不等,而不同級(jí)別在不同產(chǎn)區(qū)的含量并不呈現(xiàn)同樣的變化規(guī)律 (上表3,5,7,8),說(shuō)明牛肝菌含量水平同產(chǎn)地?zé)o關(guān)。但項(xiàng)目研究小組發(fā)現(xiàn)等級(jí)低的樣本尼古丁含量普遍較高,經(jīng)有針對(duì)性的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),影響牛肝菌中尼古丁含量的主要因素有以下幾種。

        表10 受損與未受損樣本中的尼古丁含量

        4.1 自然受損后的牛肝菌干片中尼古丁含量顯著增高 在對(duì)同一貿(mào)易等級(jí)牛肝菌干片的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),自然受損后的牛肝菌干片中尼古丁含量值明顯較高 (表10)。這一現(xiàn)象在對(duì)新鮮松茸的實(shí)驗(yàn)中也同樣得到證實(shí),10份受損鮮松茸的尼古丁含量為 157~305μg/kg,而未受損的10份鮮松茸僅為13~77μg/kg。

        上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果從內(nèi)源性次生代謝產(chǎn)物的角度可以得到科學(xué)解釋:菌體在受刺激后因生物體出于自我保護(hù)的應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生應(yīng)激物質(zhì)尼古丁。這種應(yīng)急反應(yīng)在生物界的其他物種中也普遍存在。從這一觀點(diǎn)出發(fā)可以對(duì)下述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行如下解釋。

        (1)為什么鮮牛肝菌子實(shí)體同牛肝菌干片中尼古丁的含量水平并不呈現(xiàn)干鮮比為9倍的關(guān)系 (此換算比例應(yīng)只是適用于外來(lái)污染物),而是增高很多。那是因?yàn)轷r牛肝菌子實(shí)體的干燥過(guò)程同樣是一種外來(lái)?yè)p害的刺激,隨之不斷產(chǎn)生尼古丁直至轉(zhuǎn)換酶失活,從而使尼古丁含量積累增高。

        (2)為什么速凍及鹽漬牛肝菌中尼古丁檢出值較低。其原因有二:一是尼古丁極易溶于水,我們分取速凍菌中水樣和速凍菌子實(shí)體進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其水中尼古丁含量高于子實(shí)體部分的含量;二是速凍及鹽漬都能很快地使子實(shí)體中的反應(yīng)酶失活,尼古丁產(chǎn)生的時(shí)間進(jìn)程短。

        表11 牛肝菌不同樣本的尼古丁平均含量

        4.2 牛肝菌子實(shí)體不同部位的尼古丁含量不一,其孢子產(chǎn)生器官菌管中的含量最高,說(shuō)明其尼古丁的產(chǎn)生可能與其生殖活動(dòng)有關(guān)。采集鮮牛肝菌樣本和對(duì)同一子實(shí)體牛肝菌干片樣本按菌蓋和菌柄分別進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),不同等級(jí)菌蓋中尼古丁的含量均高于菌柄,其中含量最高部位是菌管,EUROFINS蘇州實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)也證實(shí)了這一點(diǎn) (表11)。

        5 牛肝菌干片中含尼古丁的食用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及相關(guān)建議

        圖1 尼古丁化學(xué)結(jié)構(gòu)式

        5.1 尼古丁的化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 尼古丁又稱煙堿,CAS號(hào)54-11-5,分子式C10H14N2,相對(duì)分子質(zhì)量162;化學(xué)名稱為:1一甲基一2(3一吡啶基)吡咯烷,結(jié)構(gòu)式列于圖1。煙堿來(lái)源于自然界,無(wú)殘留。天然的煙堿在室溫下為無(wú)色或淡黃色的油狀液體,在20℃下的密度為1.0071 kg/m3,沸點(diǎn)為247℃ 。當(dāng)pH值大于10時(shí),主要以煙堿分子態(tài)存在,能與多種酸反應(yīng)成鹽,所生成的鹽大多易溶于水和有機(jī)溶劑。

        5.2 食用菌中尼古丁的限量合理性問(wèn)題

        (1)一個(gè)基本的事實(shí)是美味牛肝菌在中歐兩國(guó)都有悠久的食用歷史,從未發(fā)生過(guò)任何食用安全事件。此外,茄科植物中含有尼古丁是公認(rèn)的事實(shí),我們檢測(cè)了番茄和茄子,其尼古丁含量分別為68μg/kg和25μg/kg,皆同鮮牛肝菌相當(dāng),而茄子則是WHO/FAO推薦的十大健康食品之一,對(duì)其食用并無(wú)任何限制。

        目前,歐盟對(duì)牛肝菌干片的臨時(shí)限量是2.3 mg/kg,瑞士對(duì)干蘑菇的限量為4.5 mg/kg。歐盟制定臨時(shí)限量的科學(xué)依據(jù)是什么?如前所述,野生牛肝菌中尼古丁并不是使用殺蟲劑后的殘留物,而是內(nèi)源次生代謝產(chǎn)物,因而其限量不應(yīng)適用396/2005號(hào)法規(guī)中0.01 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。

        (2)確定尼古丁的限量應(yīng)充分考慮牛肝菌產(chǎn)品的食用方式。據(jù)調(diào)查,牛肝菌干片的食用方式主要有兩類:一是打碎磨細(xì)后作為調(diào)味料使用,二是直接食用。前者的日攝入量極少,而后者則需要浸泡清洗后再烹制食用,在此過(guò)程中微量的尼古丁將被溶解于水中,留在食用子實(shí)體中的含量極少。我們將檢測(cè)過(guò)尼古丁含量的牛肝菌干片樣本按食用方式先浸泡半小時(shí),取出煮沸半小時(shí)后再測(cè)試其尼古丁的含量,結(jié)果是,處理前兩個(gè)樣本的尼古丁含量各為13 558μg/kg和11 978μg/kg,而處理后的尼古丁含量各為1 007μg/kg和571μg/kg,后者只是前者的1/10~1/20,完全符合現(xiàn)行臨時(shí)限量標(biāo)準(zhǔn)。因此現(xiàn)時(shí)所依據(jù)的暴露評(píng)估數(shù)據(jù)并不完善。

        以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)證實(shí),由于牛肝菌等野生食用菌中尼古丁的含量多少,是人為不可控的,因此要確定野生食用菌中尼古丁的自然本底值是很困難的。同樣的事例也發(fā)生在香菇中:香菇中的甲醛已被證實(shí)為香菇內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,干香菇中的甲醛含量范圍為5~1 500 mg/kg,平均含量達(dá)266 mg/kg。但現(xiàn)今各主要貿(mào)易國(guó)并未對(duì)香菇中的甲醛制定任何限量標(biāo)準(zhǔn),因?yàn)閷<艺J(rèn)為,香菇中的氨基酸自然代謝產(chǎn)生的甲醛會(huì)在食物的烹飪過(guò)程中揮發(fā),不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致癌等危害;而尼古丁同樣也屬極易揮發(fā)的物質(zhì),其天然含量比甲醛低了近2個(gè)數(shù)量級(jí),制定限量顯然是不合理。歐盟官方應(yīng)充分考慮到牛肝菌中的尼古丁是內(nèi)源性次生代謝產(chǎn)物,美味牛肝菌食用歷史悠久,不曾出現(xiàn)中毒案例,有必要將尼古丁作為豁免物質(zhì),取消對(duì)其含量設(shè)限的要求,以保證中歐牛肝菌貿(mào)易的正常進(jìn)行,保障產(chǎn)業(yè)鏈上各方的合法權(quán)益。

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