唐 寅，張威威，許 鋒

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

程水源

(黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 黃岡 438000)

植物苯丙氨酸代謝相關(guān)酶基因啟動(dòng)子研究進(jìn)展

唐 寅，張威威，許 鋒

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

程水源

(黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 黃岡 438000)

苯丙氨酸代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑，主要包括苯丙烷代謝途徑和異黃酮合成代謝途徑，其中每一步都由不同酶調(diào)控。啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)程度。綜述了苯丙氨酸代謝途徑3種重要酶，即苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶和查爾酮異構(gòu)酶基因啟動(dòng)子的研究進(jìn)展。

苯丙氨酸代謝途徑；異黃酮合成途徑；啟動(dòng)子；分子機(jī)理

植物的代謝分為初級(jí)代謝和次級(jí)代謝，而次級(jí)代謝有多條途徑。從碳流的角度來(lái)看，苯丙氨酸代謝途徑是植物次生代謝最重要的途徑之一。在一個(gè)細(xì)胞中，20%以上的代謝通過(guò)丙氨酸代謝途徑，一切含苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由這一途徑直接或間接生成的。苯丙氨酸代謝主要包括2個(gè)代謝途徑，即苯丙烷代謝途徑和類黃酮合成代謝途徑[1，2]。

植物啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，它能指導(dǎo)RNA聚合酶與模板的正確結(jié)合，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。研究苯丙氨酸代謝相關(guān)酶基因的啟動(dòng)子，能從分子機(jī)理分析其代謝過(guò)程，為研究各種次生代謝產(chǎn)物的分子調(diào)控打下基礎(chǔ)[1]。

1 苯丙氨酸解氨酶基因啟動(dòng)子

1.1 苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL,EC4.3.1.5)是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，促進(jìn)黃酮、香豆素等次生代謝物的生成。PAL只存在于植物和微生物中，能夠應(yīng)答傷害、病原菌、植物激素等多種脅迫誘導(dǎo)[2]。

1.2 苯丙氨酸解氨酶基因啟動(dòng)子研究

(1)苯丙氨酸解氨酶基因啟動(dòng)子類型 植物PAL活性的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行，并且受到PAL啟動(dòng)子的影響?，F(xiàn)已在豌豆(PisumsativumL.)[3，4]、擬南芥(Arabidopsis)[5]、歐芹(Petroselinumcrispum)[6]、白楊木(Populustrichocarpa×P.deltoides)[7]、扁豆(DolichoslablabL.)[8]、菜豆(PhaseolusvulgarisL.)[9]、水稻[10]、麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)[11]等植物中獲得苯丙氨酸解氨酶基因的啟動(dòng)子；通過(guò)5’端側(cè)翼區(qū)缺失實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子一些特定區(qū)域和保守元件對(duì)PAL的表達(dá)水平有重要作用。分為4種類型，即，(1)PAL1類型，在豌豆[3]、擬南芥[5]、歐芹[6]和白楊木[7]中發(fā)現(xiàn)；(2)PAL2類型，在扁豆[8]、菜豆[9]、白楊木[7]和歐芹[6]中發(fā)現(xiàn)；(3)PAL3類型，在歐芹[6]中發(fā)現(xiàn)；(4)PAL4類型，在歐芹[6]中發(fā)現(xiàn)。

(2)苯丙氨酸解氨酶基因啟動(dòng)子GUS表達(dá) 將PAL啟動(dòng)子片段與GUS報(bào)告基因融合后轉(zhuǎn)入植物表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同植物PAL啟動(dòng)子的表達(dá)在各器官中差異很大。菜豆PAL2啟動(dòng)子[9]在木質(zhì)部和韌皮部表達(dá)，但在葉原基和莖結(jié)點(diǎn)不表達(dá)。豌豆PAL2啟動(dòng)子[5]器官特異性表達(dá)在花瓣中水平最高，在花粉囊、柱頭、根和芽中顯著表達(dá)，而在萼片、子房和葉片中基本不表達(dá)。白楊木PAL1和PAL2啟動(dòng)子[8]在葉片、莖和其他器官的初生木質(zhì)部和莖的次生木質(zhì)部表達(dá)，但在表皮和表皮下層細(xì)胞均不表達(dá)。擬南芥PAL1啟動(dòng)子[6]在幼苗發(fā)育早期有活性，在花中，萼片、花粉囊和心皮中有表達(dá)，而在成熟植物體的根和葉片的維管組織中表達(dá)量大，但在根尖、芽頂端分生組織和花瓣中不表達(dá)。

(3)苯丙氨酸解氨酶基因啟動(dòng)子順式作用元件 在豌豆[3]、歐芹[6]和白楊木[7]等植物的PAL啟動(dòng)子的順式作用元件的研究中，發(fā)現(xiàn)了不同的順式作用元件(表1)，其中TATA-box在豌豆和歐芹中發(fā)現(xiàn)，白楊木和菜豆中順式作用元件差距較大。

表1 幾種植物的PAL啟動(dòng)子順式作用元件研究Table 1 The cis-element of PAL promoter of several species plant

2 查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子

2.1 查爾酮合成酶

查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS,EC2.3.1.74)是類黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，在苯丙氨酸合成途徑中，查爾酮為類黃酮類物質(zhì)提供基本的碳架結(jié)構(gòu)，為類黃酮、黃酮醇、黃烷酮、花青素糖苷及其他物質(zhì)的合成提供保障。查爾酮合成酶在植物中廣泛存在，在很多生理生化活動(dòng)中起著重要作用，是近年來(lái)植物生理生化和分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。CHS的功能主要表現(xiàn)在色素合成、防UV照射、抵御病原真菌侵染、根瘤形成、植物育性、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸、抗蟲等方面，近年來(lái)有大量的相關(guān)報(bào)道[12]。

2.2 查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子研究

(1)查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子類型 現(xiàn)已在歐芹[13]、擬南芥[14]、芥末(SinapisalbaL.)[15，16]、豌豆[17]、法國(guó)豆(PhaseolusvulgarisL.)[18]、扁豆[19]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[20]、菜豆[21]、矮牽牛(Petuniahybrida)[22]、金魚草[23]等中獲得了查爾酮合成酶基因的啟動(dòng)子。主要分為3種類型：(1)CHS1類型，芥末[15]和豌豆[17]中發(fā)現(xiàn)；(2)CHS15類型，在法國(guó)豆[18]和菜豆[21]中發(fā)現(xiàn)；(3)CHSA類型，在矮牽牛[22]中發(fā)現(xiàn)。

(2)查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子GUS表達(dá) 將不同植物CHS基因的啟動(dòng)子片段與GUS報(bào)告基因連接，導(dǎo)入植物細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同植物的不同器官中表達(dá)差異很大。芥末CHS啟動(dòng)子[15]在幼苗中除胚軸所有器官都表達(dá)，在花中所有輪生體中都表達(dá)。金魚草CHS啟動(dòng)子[23]在不成熟種子中表達(dá)量最高。法國(guó)豆CHS15啟動(dòng)子[18]在花和根尖有表達(dá)，花中的表達(dá)僅限于花瓣中有顏色的部分，而且是瞬時(shí)表達(dá)。

表2 幾種植物的CHS啟動(dòng)子順式作用元件Table 2 The cis-element of CHS promoter of several species plant

(3)查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子順式作用元件 在對(duì)芥末[15]、法國(guó)豆[18]、豌豆[17]、擬南芥[14]、矮牽牛[22]、扁豆[19]等植物CHS啟動(dòng)子順式作用元件的研究中，發(fā)現(xiàn)了不同順式作用元件(表2)，G-box在法國(guó)豆、豌豆和擬南芥中均存在，而白芥菜和菜豆順式作用元件差別很大。

3 查爾酮異構(gòu)酶基因啟動(dòng)子

3.1 查爾酮異構(gòu)酶

查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI,EC5.5.1.6)是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的類黃酮合成相關(guān)酶，是類黃酮類色素生物合成所需的關(guān)鍵酶之一。自從通過(guò)抗體技術(shù)從菜豆中分離純化CHI以來(lái)，通過(guò)類似方法已在多種植物中分離純化出CHI。CHI是植物異黃酮途徑中植物抗毒素生物合成所必需的酶，以單體的形式普遍存在于大多數(shù)植物中，分子量因植物的種類而異。CHI的氨基酸序列和蛋白質(zhì)的三維折疊結(jié)構(gòu)在植物中具有唯一性，已被建議作為一種植物特有的基因及結(jié)構(gòu)標(biāo)記。研究表明，除植物中普遍存在CHI外，真菌、粘土霉菌和大部分γ蛋白細(xì)菌中都存在與植物CHI直向同源的類CHI蛋白，但都缺乏CHI的上游酶CHS[24]。

3.2 查爾酮異構(gòu)酶基因啟動(dòng)子研究

目前，查爾酮異構(gòu)酶基因啟動(dòng)子只在矮牽牛[25]、煙草(Nicotianaglutinosa)[26]和百合(Liliumlongiflorum)[27]等少數(shù)草本植物中獲得。其中，矮牽牛[28]包括CHIA和CHIB 2種酶基因啟動(dòng)子，是研究最深入的。CHIA基因編碼區(qū)上游存在兩個(gè)啟動(dòng)子PA1和PA2，PA1和PA2在不同矮牽?；ńM織中具有不同的啟動(dòng)活性。PA1啟動(dòng)子在花冠組織中可驅(qū)動(dòng)CHIA表達(dá)，而PA2啟動(dòng)子僅在花藥發(fā)育后期和花粉粒組織中啟動(dòng)CHIA。CHIB只有一個(gè)啟動(dòng)子，僅僅在花藥發(fā)育早期及成熟花粉組織中驅(qū)動(dòng)CHIB基因的表達(dá)。CHIA和CHIB基因啟動(dòng)子區(qū)域有37 bp的高度保守的DNA序列。

4 結(jié)語(yǔ)

苯丙氨酸代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑，其相關(guān)酶基因的分子生物學(xué)研究越來(lái)越受重視。啟動(dòng)子研究一直處于生命科學(xué)研究前沿。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，將有更多植物的苯丙氨酸解氨酶基因、查爾酮合成酶基因、查爾酮異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子被研究，從而使苯丙氨酸代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理得到更深入的了解，提高各種次生產(chǎn)物的產(chǎn)量(如大豆異黃酮)，更好地為人類服務(wù)。

[1]蔣 明，曹家樹．查爾酮合成酶基因[J]．細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007，29(4)：525～529．

[2]崔建東，李 艷，牟德華．苯丙氨酸解氨酶(PAL)的研究進(jìn)展[J]．食品工業(yè)科技，2008，29(7)：306～308．

[3]Koto H,Wada M,Muraya K,etal.Characterization of nuclear factors for elicitor-mediated activation of the promoter of the Pea phenylalanine ammonia-lyase gene 1[J].Plant Physiology,1995,108:129～139.

[4]Whitbred J M,Schuler M A.Molecular characterization of CYP73A9 and CYP82A1 P450 genes involved in plant defense in Pea[J].Plant Physiology,2000,9:47～58.

[5]Ohl S,Hedrick S A,Chory J,etal.Functional properties of a phenylalanine ammonia-lyase promoter fromArabidopsis[J].The Plant Cell,1990,9:837～848.

[6 ]Logemann E,Parniske M,Hahlbrock K.Modes of expression and common structural features of the complete phenylalanine ammonia-lyase gene family in parsley[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,6:5905～5909.

[7]Gray-Mitsumune M,Molitor E K,Cukovic D,etal.Developmentally regulated patterns of expression directed by poplar PAL promoters in transgenic tobacco and poplar[J].Plant Molecular Biology,1999,39:657～669.

[8]Leyva A,Liang X,Pintor-Toro J A,etal.Cís-element combinations determine phenylalanine ammonia-lyase gene tissue-specific expression patterns[J].The Plant Cell,1992,3:263～271.

[9]Liang X W,Dron M,Schmid J,etal.Developmental and environmental regulation of a phenylalanine ammonia-lyase-f3-glucuronidase gene fusion in transgenic tobacco plants[J].Proc Nati Acad Sci USA,1989,12:9284～9288.

[10]Zhu Q,Dabl T,Lamb C.TATA box and initiator functions in the accurate transcription of a plant minimal promoterinVitro[J].The Plant Cell,1995,10:1681～1689.

[11]張淑文，高 帆，秦小波，等．麻瘋樹苯丙氨酸解氨酶啟動(dòng)子的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建[J]．植物研究，2007，27(4)：455～459．

[12]王 燕，許 鋒，程水源．植物查爾酮合成酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007，(8)：5～9．

[13]Merkle T,Frohnmeyer H,Schulze-Lefert P,etal.Analysis of the parsley chalcone-synthase promoter in response to different lightqualities[J].Planta,1994,193:275～282.

[14]Hartmann U,Valentine W J,Christie J M.Identification of UV/blue light-response elements in theArabidopsisthalianachalcone synthase promoter using a homologous protoplast transient expression system[J].Plant Molecular Biology,1998,36:741～754.

[15]Kaiser T,Batschauer A.Cis-acting elements of theCHS1 gene from white mustard controlling promoter activity and spatial patterns of expression[J].Plant Molecular Biology,1995,28:231～243.

[16]Kaiser T,Emmler K,Kretsch T,etal.Promoter elements of the mustardCHS1 gene are sufficient for light regulation in transgenic plants[J].Plant Molecular Biology,1995,28:219～229.

[17]Qian W,Tan G,Liu H.Identification of a bHLH-type G-box binding factor and its regulation activity with G-box and Box I elements of the PsCHS1 promoter[J].Plant Cell Report,2007,26:85～93.

[18]Faktor O,Kooter J M,Dixon R A.Functional dissection of a bean chalcone synthase gene promoter in transgenic tobacco plants reveals sequence motifs essential for floral expression[J].Plant Molecular Biology,1996,32:849～859.

[19]Lindsay W P,McAlister F M,Zhu Q.KAP-2,a protein that binds to the H-box in a bean chalcone synthase promoter,is a novel plant transcription factor with sequence identity to the large subunit of human Ku autoantigen[J].Plant Molecular Biology,2002,49:503～514.

[20]Yu L M,Lamb C J,Dixon R A.Purification and biochemical characterization of proteins which bind to the H-box cis-element implicated in transcriptional activation of plant defense genes[J].The Plant Journal,1993,6:805～816.

[21]Meer I M,Spelt C E,Mol J N,etal.Promoter analysis of the chalcone synthase(chsA) gene ofPetuniahybrida:a 67 bp promoter region directs flower-specific expression[J].Plant Molecular Biology,1990,15:95～109.

[22]Lozoya E,Block A,Lois R,etal.Transcriptional repression of light-induced flavonoid synthesis by elicitor treatment of cultured parsley cells[J].The Plant Journal,l991,2:227～234.

[23]Fritze K,Staiger D,Czaja L,etal.Developmental and UV light regulation of theSnapdragonchalconesynthase promoter[J].The Plant Cell,1991,9:893～905.

[24]張黨權(quán)，譚曉風(fēng)，王曉紅．查爾酮合酶與查爾酮異構(gòu)酶基因特征及轉(zhuǎn)基因應(yīng)用[J]．中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(2)：87～91．

[25]Tunen A J V,Hartman S A,Mol J N M,etal.Regulation of chalcone isomerase(CHI) gene expression in petunia hydria:the use of alternative promoters in corolla,anthers and pollen [J].Plant Mol Biol,1989,12:539～551.

[26]范惠琴，姚泉洪，黃曉敏，等．矮牽牛查爾酮黃烷酮異構(gòu)酶(chiA)基因啟動(dòng)子的克隆和測(cè)序[J]．上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，14(3)：14～16．

[27]Tunen A J,Hartman S A,Mur L A,etal.Pollen- and anther-specific chí promoters fromPetunia:tandem promoter regulation of the chíA Gene[J].The Plant Cell,1990,5:393～401.

[28]Tunen A J,Hartman S A,Mur L A,etal.Regulation of chalcone flavanone isomerase (CHI) gene expression inPetuniahybrida:the use of alternative promoters in corolla,anthers and pollen[J].Plant Molecular Biology,1989,12:539～551.

2010-03-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30971974)；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2008CDA061)；湖北省教育廳產(chǎn)學(xué)研合作資助項(xiàng)目(CXY2009B009)

唐 寅(1983-)，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向?yàn)殂y杏分子生物學(xué).

程水源，E-mail: s_y_cheng@sina.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.020

Q946.5

A

1673-1409(2010)02-S068-04