楊 玲，安 麗，張龍崗，董學(xué)颯，付佩勝

(山東省淡水水產(chǎn)研究所， 山東 濟(jì)南 250117)

高體革鯻5種同工酶的組織特異性研究

楊 玲，安 麗，張龍崗，董學(xué)颯，付佩勝

(山東省淡水水產(chǎn)研究所， 山東 濟(jì)南 250117)

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法，分析了高體革鯻(Scortumbarcoo)的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、眼睛等6種組織中的5種同工酶(乳酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、酯酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這5種酶在表型、分布和活性上均表現(xiàn)出明顯的組織特異性，且與各組織執(zhí)行的生理機(jī)能相一致。

高體革鯻(Scortumbarcoo)；同工酶；組織特異表達(dá)

高體革鯻(Scortumbarcoo)為原產(chǎn)于澳大利亞的淡水魚(yú)類(lèi)，隸屬于鱸形目(Perciformes)鯻科(Terapontidae)革鯻屬 (Scortum)。魚(yú)體呈紡錘形，體側(cè)有一至數(shù)個(gè)黑色晶瑩的橢圓形斑塊及零星分布的小斑塊，宛如黑色的寶石，因而得名“寶石鱸”。因其外形美觀，可食部分比例大，無(wú)肌間骨，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)力、抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，適于池塘及網(wǎng)箱養(yǎng)殖，故被引進(jìn)世界各地。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)對(duì)高體革鯻的生物學(xué)特性、生長(zhǎng)發(fā)育、養(yǎng)殖技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)成分分析、核型分析等進(jìn)行過(guò)研究[1～5]，但未見(jiàn)有關(guān)其同工酶方面的報(bào)道。為此，本研究采用聚丙烯酰胺垂直板不連續(xù)電泳的方法，對(duì)高體革鯻的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肌肉、眼睛等6種組織的5種同工酶——乳酸脫氫酶(LDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)、酯酶(EST)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)進(jìn)行了分析，以期為高體革鯻的生化遺傳結(jié)構(gòu)研究、種質(zhì)資源鑒定以及遺傳多樣性分析提供可借鑒的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚(yú)取自山東省淡水水產(chǎn)研究所，規(guī)格為體長(zhǎng)25～30 cm，體重525～670 g的高體革鯻成魚(yú)。

1.2 方法

(1)樣品制備 共取成魚(yú)30尾，剪斷尾動(dòng)脈和鰓，在流水中放血以減少組織帶血。活體解剖，迅速摘取眼睛、心臟、腎臟、脾臟、肝臟、肌肉等組織，用預(yù)冷的0.8%生理鹽水將各組織沖洗干凈，取適量稱(chēng)重，放入預(yù)冷的研缽中，用消毒的剪刀適當(dāng)剪碎，加入預(yù)冷的0.01 mol/L的pH 7.4的磷酸緩沖液(組織∶緩沖液=1 g∶3 mL)，置冰浴中研磨勻漿，勻漿液置4 ℃冰箱抽提1～2 h后，高速冷凍離心機(jī)(4 ℃)15 000 r/m離心30 min，取上清液，加入等體積的40%的蔗糖溶液，分裝后置 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)電泳及染色 采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法，分離膠濃度(T)為7%或7.5%，濃縮膠濃度為4%或3%。電泳緩沖液為T(mén)ris-Gly ，高離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH 8.3)或低離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH 8.7)。梯度膠的濃度和緩沖系統(tǒng)見(jiàn)表1，點(diǎn)樣量為20 μL，以溴酚藍(lán)作指示劑，電泳在4 ℃冰箱進(jìn)行。同工酶的染色方法參照文獻(xiàn)[6～9]稍作改進(jìn)。同工酶的命名和分析參照文獻(xiàn)[9～11]，以各酶帶的相對(duì)遷移率(Rf)從小到大依次命名，即向陽(yáng)極泳動(dòng)最快的編為1號(hào)，其余依次順序編為2，3，4，…，同一基因位點(diǎn)的不同等位基因按照從陰極到陽(yáng)極的順序依次標(biāo)記為a、b、c，…。

表1 用于分析高體革鯻同工酶的名稱(chēng)、編號(hào)、緩沖系統(tǒng)和凝膠濃度Table 1 The name ,serial number ,buffer system and gel concentration for analyzing the isozyme of S. barcoo

注：TG 8.3 指Tris-甘氨酸高離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH 8.3)；TG 8.7指Tris-甘氨酸低離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH 8.7)

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化物酶(POD，E.C.1.11.1.7)

S:脾臟；K:腎臟；L:肝臟；M:肌肉；H:心臟； E:眼睛圖1 高體革鯻不同組織的POD電泳圖譜Figure 1 Electrophoretogram of POD in various tissues of S. barcoo

S:脾臟；K:腎臟；L:肝臟；M:肌肉;H:心臟； E:眼睛圖2 高體革鯻不同組織的EST電泳圖譜Figure 1 Electrophoretogram of EST in various tissues of S. barcoo

高體革鯻不同組織的POD電泳圖譜見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，其 POD由5個(gè)基因座位編碼(Pod-1、2、3、4、5)，其中Pod-1、Pod-2和Pod-5為多態(tài)位點(diǎn)，Pod-1在脾臟、腎臟中表達(dá)為由同一位點(diǎn)編碼的2條同二聚體酶帶，在心臟中檢測(cè)到1條酶帶，即Pod-1a。Pod-1在心臟 、脾臟中含量較高，在腎臟中含量稍低，在肝臟、肌肉和眼睛中沒(méi)有檢測(cè)到。Pod-2在脾臟、腎臟和肝臟中有表達(dá)，在心臟、肌肉和眼睛中沒(méi)有檢測(cè)到酶的活性，其中Pod-2a僅在脾臟和腎臟中表達(dá)，Pod-2b和Pod-2c在脾臟、腎臟和肝臟中有表達(dá)，肝臟中含量較少。除肌肉組織外，其他組織中都有Pod-3和Pod-4的表達(dá)，心臟和眼睛的含量較少，脾臟和腎臟中的含量較高，眼睛中Pod-3和Pod-4酶帶的遷移速度較其他3種組織中的快。Pod-5僅在脾臟和腎臟中有表達(dá)，其他組織中均沒(méi)有檢測(cè)到其活性，在脾臟中含量較高。

在肌肉組織中沒(méi)有檢測(cè)到POD活性，其他各組織均表達(dá)為2～8條酶帶。其中脾臟和腎臟中POD的活性最強(qiáng)，染色也最深。酶譜分析表明，高體革鯻6種組織中沒(méi)有任何2種組織具有完全相同的POD表達(dá)情況，說(shuō)明高體革鯻的POD同工酶有較為顯著的組織特異性。

2.2 酯酶(EST，E.C.3.1.1.1)

高體革鯻不同組織的EST電泳圖譜見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，EST在各組織中都有表達(dá)，共檢測(cè)到5條酶帶。Est-1在肝臟和腎臟中表達(dá)最強(qiáng)，脾臟中的表達(dá)次之，在心臟中表達(dá)很弱，在眼睛和肌肉中沒(méi)有表達(dá)。Est-2也是在肝臟和腎臟中表達(dá)最強(qiáng)，脾臟中的表達(dá)次之，在心臟、眼睛和肌肉中沒(méi)有表達(dá)。Est-3和Est-4在各組織中均有表達(dá)，但是表達(dá)的強(qiáng)度不一，Est-3在肝臟和腎臟中表達(dá)最強(qiáng)，脾臟中次之，心臟和眼睛中較弱，肌肉中表達(dá)最少。Est-4在腎臟、眼睛和心臟中表達(dá)較強(qiáng)，在脾臟和肝臟中較弱，在肌肉中表達(dá)最弱。Est-5只在腎臟中有表達(dá)，在其他組織中沒(méi)有檢測(cè)到其活性。

2.3 蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH，E.C.1.1.1.37)

S:脾臟；K:腎臟；L:肝臟；M:肌肉；H:心臟； E:眼睛圖3 高體革鯻不同組織的MDH電泳圖譜Figure 3 Electrophoretogram of MDH in various tissues of S. barcoo

S:脾臟；K:腎臟；L:肝臟；M:肌肉;H:心臟； E:眼睛圖4 高體革鯻不同組織的CAT電泳圖譜Figure 4 Electrophoretogram of CAT in various tissues of S. barcoo

S:脾臟；K:腎臟；L:肝臟；M:肌肉;H:心臟； E:眼睛圖5 高體革鯻不同組織的LDH電泳圖譜Figure 5 Electrophoretogram of LDH in various tissues of S. barcoo

硬骨魚(yú)類(lèi)的MDH為二聚體，存在互不形成異聚體的上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)2部分，均是由2個(gè)基因編碼的二聚體酶[12]。高體革鯻不同組織的EST電泳圖譜見(jiàn)圖3。MDH在高體革鯻中可以檢測(cè)到這2種類(lèi)型的酶帶?？拷?yáng)極的為s-MDH型，表達(dá)為3條酶帶，靠近陰極的為m-MDH型，表達(dá)為1～2條酶帶。MDH在各組織中的表達(dá)存在差異，在肝臟和腎臟中的含量最豐富，心臟、脾臟、眼睛等組織的含量次之，在肌肉中的表達(dá)最少。m-MDHb2只在肝臟和腎臟中表達(dá)，其他組織中沒(méi)有表達(dá)。 s-MDH在6種組織中的表達(dá)基本一致，在肝臟和腎臟中表達(dá)最強(qiáng)，在肌肉中表達(dá)最弱。

2.4過(guò)氧化氫酶(CAT，E.C.1.11.1.16)

高體革鯻不同組織的CAT電泳圖譜見(jiàn)圖4，可見(jiàn)在高體革鯻脾臟中CAT的活性最強(qiáng)，在肝臟和腎臟中CAT的活性較弱，在心臟、肌肉和眼睛中沒(méi)有檢測(cè)到其活性。由此可見(jiàn)，高體革鯻的CAT同工酶存在較為明顯的組織差異。

2.5乳酸脫氫酶(LDH，E.C.1.1.1.27)

高體革鯻不同組織的LDH電泳圖譜見(jiàn)圖5，共檢測(cè)到5條酶帶，其中靠近陽(yáng)極的有3條酶帶。LDH-1和LDH-2在肝臟中表達(dá)最強(qiáng)，心臟和肌肉中的表達(dá)較弱，其他組織中沒(méi)有表達(dá)；LDH-3在各組織中都有表達(dá)，在腎臟和心臟中的表達(dá)最強(qiáng)，肝臟和眼睛中的表達(dá)次之，肌肉和脾臟中表達(dá)最弱；LDH-4只在腎臟和肝臟中表達(dá)，其他組織中沒(méi)有表達(dá)；LDH-5只在心臟中有表達(dá)?？梢?jiàn)，高體革鯻的LDH同工酶具有顯著的組織特異性。

3 結(jié)論與討論

3.1高體革鯻同工酶的表達(dá)具有明顯的組織特異性

高體革鯻的6種組織中，肌肉共檢測(cè)到3種酶，MDH、EST和LDH，其含量比在其他組織中明顯要低。眼睛和心臟一樣，除CAT以外的其他4種酶都有表達(dá)，心臟中的表達(dá)量較高，眼睛中的表達(dá)量比較低。脾臟、腎臟和肝臟中這5種酶全部表達(dá)，相對(duì)而言，脾臟表達(dá)量較小，肝臟和腎臟中這5種酶的表達(dá)量是最多的。

從本研究可以看出，高體革鯻同工酶的組織特異性，表現(xiàn)在以下幾方面：(1)位點(diǎn)的表達(dá)。某些位點(diǎn)的同工酶僅限于某種組織所特有，在其他組織中，該同工酶不表達(dá)或活性太低而檢測(cè)不出。如m-MDH-b2僅在肝臟和腎臟中表達(dá)，其他組織中沒(méi)有表達(dá)。LDH-5只在心臟中表達(dá)，LDH-4只在肝臟和腎臟中表達(dá)；ESt-5只在腎臟中表達(dá)。(2)位點(diǎn)表達(dá)的程度即酶活性的強(qiáng)弱不同。①同一位點(diǎn)在不同組織中的相對(duì)含量或表達(dá)的數(shù)量差別很大，如Pod-3和Pod-4在脾臟和腎臟中表達(dá)較強(qiáng)，其他4種組織中表達(dá)較弱或不表達(dá)。Est-2在肝臟和腎臟中表達(dá)較強(qiáng)，其他組織中較弱。②不同位點(diǎn)在不同組織中的相對(duì)活性不同，如心臟中的Pod-1的表達(dá)比其他位點(diǎn)要強(qiáng)，而其他組織的正好相反，Pod-2、Pod-3和Pod-4的表達(dá)都比Pod-1強(qiáng)。腎臟和肝臟中的EST-2的表達(dá)比其他位點(diǎn)強(qiáng)，而其他組織中的EST-4的表達(dá)最強(qiáng)。(3)等位基因表達(dá)的差異。由于復(fù)等位基因的存在，不同組織中會(huì)有不同的等位基因表達(dá)，結(jié)果同一位點(diǎn)的酶譜表型在不同組織中有明顯的差異，或有時(shí)等位基因編碼的亞基不一定完全表達(dá)或不能通過(guò)電泳鑒定其產(chǎn)物，即存在“啞等位基因”或“無(wú)效基因”，結(jié)果導(dǎo)致不同組織中同一位點(diǎn)的酶譜表型出現(xiàn)差異[13]。如Pod-2在脾臟和腎臟中有3條帶，而在其他組織中有2條帶或者不表達(dá)。眼睛中Pod-3和Pod-4的遷移速度比其他組織中的略快，可能是由于基因的突變或酶蛋白的修飾所造成的，是眼睛區(qū)別于其他組織的標(biāo)記。

3.2 高體革鯻同工酶組織特異性與功能的相關(guān)性

(1)過(guò)氧化物酶(POD)可利用H202氧化供氫體，降解嘌呤、酚和胺等物質(zhì)并減輕其毒性[14]。本研究也表明，在血流豐富、白細(xì)胞及吞噬細(xì)胞較多的脾臟、腎臟、肝臟、心臟中POD的表達(dá)較強(qiáng)，而在肌肉中沒(méi)有表達(dá)。與青海湖裸鯉和鱖魚(yú)的POD酶譜相似[15，16]，而與岱衢族大黃魚(yú)和道氏虹鱒的POD酶譜不同[17，18]，岱衢族大黃魚(yú)的心臟中沒(méi)有檢測(cè)到POD活性，道氏虹鱒肌肉中的POD表達(dá)量較高。

(2)酯酶(EST)是催化酯類(lèi)化合物水解并進(jìn)入中間代謝的重要酶類(lèi)，對(duì)于酯類(lèi)代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)與功能具有一定作用，還能催化酯鍵水解，有解毒作用[15]。本研究中EST同工酶在高體革鯻肝臟中表達(dá)最強(qiáng)，是與肝臟作為機(jī)體重要的解毒器官密切相關(guān)的，這和其他魚(yú)類(lèi)的酯酶分布情況類(lèi)似[13，15～20]。EST同工酶在高體革鯻腎臟和脾臟中的表達(dá)也較強(qiáng)，與腎臟和脾臟作為主要的代謝和造血器官有關(guān)。這與褐點(diǎn)石斑魚(yú)、赤點(diǎn)石斑魚(yú)、岱衢族大黃魚(yú)等類(lèi)似，而和波紋唇魚(yú)不同，后者在腎臟和脾臟中沒(méi)有表達(dá)。高體革鯻肌肉中EST僅檢測(cè)到Est-3和Est-4兩條酶帶，且染色較淺，說(shuō)明其活性較弱。這和波紋唇魚(yú)、岱衢族大黃魚(yú)、赤點(diǎn)石斑魚(yú)、鱖魚(yú)等相似，和道氏虹鱒不同，后者肌肉中EST活性較強(qiáng)。本研究中Est-3和Est-4具有廣泛的組織分布，在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行最基本的生理功能。EST-5只在腎臟中有表達(dá)，是腎臟組織的特征性酶帶。

(3)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)是三羧酸循環(huán)中的一種酶，在細(xì)胞中的功能主要是使蘋(píng)果酸脫氫參與糖酵解后的有氧代謝，因此，MDH在心臟、肝臟和腎臟等有氧代謝旺盛的組織中染色較深[13]。高體革鯻的MDH同工酶也分上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)2種類(lèi)型，6種組織都有s-MDH酶帶，在肝臟和腎臟中活性最強(qiáng)，組織間差異不大；而m-MDH具有明顯的組織特異性，在肝臟和腎臟中含量豐富，其他組織中含量較少或無(wú)。這與岱衢族大黃魚(yú)的MDH酶譜類(lèi)似[17]，而與石斑魚(yú)和道氏虹鱒不同[18～21]，后者各組織中都存在m-MDH，而s-MDH酶帶有顯著的組織特異性。

(4)過(guò)氧化氫酶(CAT)為二聚體酶，能將體內(nèi)的H2O2分解為H2O和O2，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，存在于動(dòng)物的肝和紅細(xì)胞中，為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理[15]。本研究中高體革鯻脾臟中的CAT活性最強(qiáng)，肝臟和腎臟中也有表達(dá)，在其他組織中沒(méi)有檢測(cè)到其活性，這與脾臟作為造血和免疫的重要器官，肝臟作為機(jī)體重要的解毒器官，腎臟具有內(nèi)分泌方面的功能，可以分泌腎素、前列腺素、激肽、促紅細(xì)胞生成素，刺激骨髓造血等功能密切相關(guān)的。本研究和虹鱒及青海湖裸鯉的CAT酶譜有差異[15，22]，CAT同工酶在青海湖裸鯉肝臟和腎臟中表達(dá)最強(qiáng)，心臟中較弱，肌肉中沒(méi)有表達(dá)；虹鱒的眼睛中有CAT活性表達(dá)。

(5)乳酸脫氫酶(LDH)參與糖酵解，在無(wú)氧條件下能將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸還原為乳酸，產(chǎn)能以維持機(jī)體的能量需要。魚(yú)類(lèi)的LDH一般是由A、B、C 3個(gè)基因位點(diǎn)編碼的四聚體酶，其中A、B位點(diǎn)存在于各種組織中，而C位點(diǎn)則局限于特定的組織器官中[23]。一般來(lái)說(shuō)，LDH-B4主要位于好氧性的器官組織如心、腦中，LDH-A4主要位于厭氧性器官組織如肌肉、肝臟中[20]。

本研究結(jié)果表明，高體革鯻的LDH由3個(gè)基因座位編碼，其中A和B 2個(gè)基因合成的亞基組合成3種不同的四聚體，其中LDH4對(duì)應(yīng)為L(zhǎng)DH-A4， LDH5對(duì)應(yīng)為L(zhǎng)DH-B4。LDH1、LDH2和LDH3是否為C位點(diǎn)表達(dá)的產(chǎn)物或是由LDH-A和LDH-B的復(fù)等位基因造成的還有待進(jìn)一步研究。在魚(yú)類(lèi)中，A與B亞基的結(jié)合受阻，不能形成經(jīng)典的5條酶帶的現(xiàn)象是較多的[17，19～20]，王金星等[24]認(rèn)為，亞基的結(jié)合受阻所形成的酶帶減少是進(jìn)化過(guò)程中亞基相互結(jié)合的位點(diǎn)發(fā)生變異的必然結(jié)果。從高體革鯻的LDH酶譜可以看出，在肝臟和腎臟中LDH-4的活性最強(qiáng)，與該器官的厭氧代謝有關(guān)。LDH5只在心臟中有表達(dá)，與心臟的有氧代謝相關(guān)。肌肉和脾臟中LDH活性較弱。其他魚(yú)類(lèi)肌肉中的LDH同工酶活性較強(qiáng)[12,13,15，20]，而本研究中高體革鯻肌肉的LDH活性卻顯得較弱，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

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2010-01-05

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(優(yōu)質(zhì)抗病速生魚(yú)類(lèi)良種選育)

楊 玲(1967-)，女，山東濟(jì)南人，研究員，主要從事遺傳育種技術(shù)研究.

付佩勝，E-mail :jnsfu@126.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.013

Q55;Q959.483

A

1673-1409(2010)02-S036-05