羅家琴

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

陳紅頌

(湖北省畜牧獸醫(yī)局，湖北 武漢 430060)

黃祥春，王家圣

(湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010)

楊 軍

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025;湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010)

3個(gè)外種豬群FUT1基因多態(tài)性研究

羅家琴

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

陳紅頌

(湖北省畜牧獸醫(yī)局，湖北 武漢 430060)

黃祥春，王家圣

(湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010)

楊 軍

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025;湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場，湖北 荊州 434010)

采用PCR-RFLP方法，對(duì)3個(gè)外種豬群FUT1基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，杜洛克豬群中檢測(cè)到AA、AG和GG 3種基因型，長白和大白豬群中僅檢測(cè)到GG和AG 2種基因型，未檢測(cè)到EFC18抗性AA基因型。卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)外種豬群該位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg遺傳平衡(Pgt;0.05)。群體中該位點(diǎn)純合度較高，雜合度較低，除杜洛克豬群具有中度遺傳多態(tài)性外，其余2個(gè)豬群該位點(diǎn)遺傳多態(tài)性較低?？稍诤罄m(xù)的育種方案中實(shí)施基因型選配，擴(kuò)大群體中EFC18抗性AA基因型個(gè)體數(shù)量。

豬(Susscrofa)；FUT1基因；PCR-RFLP；多態(tài)性

仔豬腹瀉和水腫病是一種重要的傳染病，此病從出生到斷奶這一階段的死亡率高達(dá)11.5%～29.5%[1]。仔豬斷奶后水腫病和腹瀉病主要由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F18(EnterotoxigenicEscherichiacoliF18,ECF18)黏附于小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣并產(chǎn)生腸毒素引起，ECF18能否致病取決于小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣有無受體[2～3]。研究發(fā)現(xiàn)，位于F18受體基因一側(cè)的α-1巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因(α-1 fucosyltransferase gene,FUT1)可作為F18介導(dǎo)的粘附呈敏感性或抗性遺傳性狀的候選基因。FUT1基因定位于豬第6號(hào)染色體上，其開放閱讀框(ORF)全長1 098 bp，其中第307位的G→A點(diǎn)突變產(chǎn)生A和G2個(gè)等位基因，G等位基因?qū)等位基因顯性。該G→A點(diǎn)突變導(dǎo)致第103位編碼產(chǎn)物由丙氨酸(Ala)轉(zhuǎn)換為蘇氨酸(Thr)，改變FUT1酶的活性，從而抑制ECF18對(duì)仔豬小腸的粘附[4～5]。因此，F(xiàn)UT1基因的AA基因型為ECF18抗性，GG和AG基因型為ECF18易感。

長白、大白和杜洛克是我國生產(chǎn)瘦肉型優(yōu)質(zhì)商品豬應(yīng)用最廣泛的3大外種豬，本研究以桑梓湖種豬場3個(gè)外種豬為試驗(yàn)材料，檢測(cè)FUT1基因PCR-RFLPs多態(tài)性，并進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，以期通過標(biāo)記輔助育種措施，增加本場豬群中ECF18抗性基因型AA個(gè)體的數(shù)目，增強(qiáng)豬群抗仔豬腹瀉與水腫病的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以湖北省畜牧獸醫(yī)局桑梓湖種豬場核心群種豬共51頭種豬為試驗(yàn)材料，其中杜洛克種豬10頭(5公5母)，長白豬24頭(7公17母)，大白豬17頭(6公11母)。耳號(hào)鉗采集豬只耳組織約50 g，放置于盛有70%乙醇的離心管中，-70 ℃保存待用。標(biāo)記樣品號(hào)和記錄豬只耳號(hào)。

1.2 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[6]提取耳組織基因組DNA，-20 ℃保存。采用V?geli[4]的引物：上游引物，5’-CTT CAG CCA GGG CTC CTT TAA G-3’；下游引物，5’-CTT CCT GAA CGT CTA TCA AGA CC-3’，擴(kuò)增片段421 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 目的片段PCR擴(kuò)增及酶切鑒定

PCR反應(yīng)體系中：模板DNA 100 ng，10×buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.25 μL，Taq DNA聚合酶1 U，加ddH2O至25 μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

RFLP酶切分析：酶切體系中10×buffer(含BSA)1.5 μL，PCR產(chǎn)物6 μL，Hin6Ⅰ0.5 μL，加ddH2O至10 μL，37 ℃恒溫水浴孵育16 h。2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切產(chǎn)物，記錄個(gè)體基因型。

1.4 群體遺傳學(xué)分析

采用POPGEN32軟件計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、基因位點(diǎn)雜合度(HE)和多態(tài)信息含量(PIC)，群體Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗(yàn)(df=1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

M為DL2000 DNA marker;1～8為421 bp特異性PCR產(chǎn)物圖1 FUT1基因特異性PCR產(chǎn)物Figure 1 PCR products of FUT1 gene

M為DL2000 DNA marker;13為AA基因型；2,6,9,10,11,12為GG基因型；1,3,4,5,7,8為AG基因型圖2 FUT1基因Hin6Ⅰ酶切結(jié)果Figure 2 Hin6Ⅰ restriction results of FUT1 gene

對(duì)整個(gè)試驗(yàn)豬群的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，獲得與目標(biāo)片段大小一致的產(chǎn)物，且產(chǎn)物條帶清晰無雜帶、穩(wěn)定性和特異性好，可直接用于酶切分析(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

所擴(kuò)增的FUT1基因421 bp片段存在2個(gè)Hin6Ⅰ酶切位點(diǎn)，可產(chǎn)生241 bp、93 bp和87 bp共3個(gè)片段，定義為G等位基因；當(dāng)?shù)?07位酶切位點(diǎn)發(fā)生G→A突變，Hin6Ⅰ酶切產(chǎn)生328 bp和93 bp 2個(gè)片段，定義為A等位基因。酶切產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳分型，因93 bp和87 bp 2個(gè)片段大小非常接近，電泳時(shí)重疊為1條帶，故AA和GG純合子均為2條帶，AG雜合子為3條帶，但3種基因型可明顯區(qū)分(圖2)。

2.33個(gè)外種豬群FUT1基因群體遺傳學(xué)分析結(jié)果

3個(gè)外種豬群FUT1基因頻率和等位基因頻率結(jié)果以及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)結(jié)果見表1。從表1可以看出，除杜洛克豬群檢測(cè)到1個(gè)AA抗性基因型外，其余2個(gè)豬群均未檢測(cè)到AA基因型。杜洛克豬群中AG基因型略占優(yōu)勢(shì)，A等位基因頻率為0.350 0，G等位基因頻率為0.650 0。長白豬群和大白豬群中GG為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率分別為0.875 0和0.823 5。G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，基因頻率分別為0.937 5和0.911 8。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)結(jié)果表明，3個(gè)外種豬群該位點(diǎn)均處于遺傳平衡狀態(tài)(Pgt;0.05)。

表1 3個(gè)外種豬群FUT1基因頻率和基因型頻率Table 1 Allelic and genotypic frequency of FUT1gene in 3 foreign pig herds

表2 3個(gè)外種豬群FUT1基因多態(tài)性分析結(jié)果Table 2 Polymorphism of FUT1gene in 3 foreign pig herds

3個(gè)外種豬群FUT1基因多態(tài)性分析結(jié)果見表2。除純合度、雜合度能反映群體的遺傳變異外，衡量群體一個(gè)位點(diǎn)的遺傳變異指標(biāo)還有多態(tài)信息含量(PIC)。對(duì)于一個(gè)群體而言，PIC值高、等位基因數(shù)目多、雜合度大，則該位點(diǎn)的遺傳變異性就高，有較大的選擇潛力；反之則說明該群體雜合度小、基因純合度高，可以看作是純系加以利用。從表2可以看出，就FUT1基因位點(diǎn)而言，長白豬群和大白豬群純合度高，雜合度低，但其多態(tài)信息含量很低。杜洛克豬群該位點(diǎn)純合度不高而具有一定的雜合度，因其0.2lt;PIClt;0.5為中度多態(tài)，故可在后續(xù)選育方案中實(shí)施中等強(qiáng)度的選擇，也可實(shí)施分化選育，即通過AG個(gè)體與AA個(gè)體交配或AG個(gè)體間交配，逐步選留純合的AA個(gè)體，培育抗仔豬腹瀉和水腫病的抗病種豬。

3 討論

畜禽抗病性狀是一個(gè)復(fù)雜的閾性狀，受到遺傳和環(huán)境因素的共同影響，常規(guī)的表型選擇難以獲得理想的改良效果。利用標(biāo)記輔助育種(Marker-assistant Breeding，MAB)可以有效解決這個(gè)難題，前提是找到與抗病性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，杜洛克、長白豬和大白豬群中均存在FUT1基因多態(tài)性，均檢測(cè)到了AA抗性基因型[4,7～10]。本研究僅在杜洛克豬群中檢測(cè)到了AA抗性基因型，長白豬群和大白豬群均未檢測(cè)到AA純合子。這可能與不同群體的選育背景有關(guān)，也可能與群體樣本大小有關(guān)。3個(gè)豬群中G等位基因均占優(yōu)勢(shì)，3個(gè)群體FUT1基因位點(diǎn)均處于遺傳平衡狀態(tài)，這與已有的研究結(jié)果相符。

多態(tài)性分析結(jié)果顯示，3個(gè)外種豬群FUT1基因位點(diǎn)純合度都較高，但以EFC18易感基因型GG為主，且3個(gè)群體多態(tài)信息含量均偏低。在生產(chǎn)實(shí)踐中，對(duì)于多態(tài)信息含量很低的長白和大白豬群，宜采用基因型選配措施，即采取AG×AG的同質(zhì)選配，在后代中選留AA基因型個(gè)體；對(duì)具有中度多態(tài)信息含量的杜洛克豬群，可開展中等強(qiáng)度的選擇，同時(shí)結(jié)合AA×AA和AG×AG的同質(zhì)選配，以期培育出抗仔豬腹瀉和水腫病的優(yōu)質(zhì)種豬。FUT1基因位于豬6號(hào)染色體上，與血型抑制因子S、紅細(xì)胞酶系統(tǒng)以及氟烷基因(RYR1)緊密連鎖，其中RYR1基因的n等位基因是導(dǎo)致豬應(yīng)激綜合癥和PSE肉的主因，但同時(shí)其N等位基因?qū)τ谪i的生長發(fā)育性能又具有顯著的正遺傳效應(yīng)。故在進(jìn)行基因型同質(zhì)選配的同時(shí)應(yīng)緊密結(jié)合性能測(cè)定，只有選留那些具有較高估計(jì)育種值(Estimated Breeding Value，EBV)的AA基因型個(gè)體，才能培育出既高產(chǎn)又抗病的種豬新品系。

[1]Bush E.National Swine Survey:Morbidity/mortality and health management of swine in the United States[M].Colorado:USDA-ApHIS-VS,1992.7～9.

[2]Bertin M,Ducher-Suchaux F.Relationship between virulence and adherence of various enterotoxigenicEscherichiacoli:strains to isolated intestinal epithelial cells from Chinese Meishan and European large white pigs[J].Am J Vet Res,1991,52:45～49.

[3]Nagy B,Fekete Z.EnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC) in farm animal[J].VET Res,1999,30:259～284.

[4]V?geli P,Meijerink E,Fries R.A molecular test for the detection ofE.coliF18 receptors:a breakthrough in the struggle against edema disease and postweaning diarrhea in swine[J].Scheiz Arch Tierheikd,1997,139:479～484.

[5]Meijerink E,Fries R,Vgeli P,etal.Two α(1,2) fucosyltransferase genes on porcine chromosome 6q11 are closely linked to the bloodgroup inhibitor (S) andEscherichiacoliF18 receptor (ECF18R) Loci[J].Mamm Genome,1997,8:736～741.

[6]楊 軍，唐登華，羅家琴.一種快速提取鴨基因組DNA的方法[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，(10)：113～114.

[7]周仲兒，劉月環(huán).豬大腸桿菌F18受體基因型測(cè)定初報(bào)[A].陳國宏.Animal Biotechnology Bulletin[C].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.107～109.

[8]施啟順，黃生強(qiáng)，柳小春，等.不同豬種E.coliF18受體基因的多態(tài)性[J].遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(3)：221～224.

[9]晏學(xué)明，任 軍，郭源梅，等.豬α1-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因(FUT1)在26個(gè)中外豬種中的遺傳變異研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(9)：830～834.

[10]張引紅.中外六個(gè)豬種FUT1基因多態(tài)性研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(8)：487～489.

2010-03-16

羅家琴(1979-)，女，重慶沙坪壩人，農(nóng)學(xué)碩士，講師，主要從事動(dòng)物分子免疫學(xué)研究.

王家圣，E-mail: hbszh1962@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.010

Q346+5;S828

A

1673-1409(2010)02-S026-03